底物显色是最后一步,也是最有文章可做的一步。显色的标记方式有生物素标记、地高辛标记、各种酶标记等等,酶标的底物又有各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物可供选择,显色方法多种多样,下面我们针对常用的几类方法进行总结对比分析,供大家方便在以后实验中根据自己需求进行选择。
酶促反应较生物素安全且反应快速,是wb
中的主流显色方法。酶促反应根据不同底物显色方法又包括化学发光和底物显色。化学发光法灵敏度高,可以达到pg级,而底物显色由于直接显色而操作简单且成本低。最为大家所熟悉的底物显色当数hrp(辣根过氧化物酶,horseradish
peroxidase )和ap(碱性磷酸酶,alkaline phosphatase )。
hrp
这是最常见的酶促发光或显色的交联酶,由于hrp 比活高、分子量小、特异性强、稳定性好和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。hrp的底物主要包括化学发光底物和生色底物两大类,对于底物的选择,主要考虑的是灵敏度、背景和使用的方便性和稳定性。
1 生色底物
生色底物显色主要是利用底物在有hrp
和h2o2的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测wb
的结果。生色底物主要包括dab、4-cn、cn/dab、aec和tmb等。表1对这4种生色底物从不同方面进行比较。其中,dab应该是最熟悉的底物,灵敏度高,特异性好,缺点就是需要现配现用,显色后光照数小时会褪色,不能永久保存,而且有毒。4-cn反差大容易拍照,可与dab联用。tmb的信噪比高,成分安全,特别合适于灵敏度要求高的wb,但是也要避免由于灵敏度高而引起的高背景,因此可以相应的延长封闭的时间和注意洗涤的次数。aec各方面性质与dab相似,但灵敏度要差一点。
2 化学发光底物
化学发光底物最常用的是鲁米诺(luminol
),化学发光法由于仅在酶和底物都存在的时候才会发光,不同于生色反应,所以特别适合在同一张膜上对不同的目标蛋白分别进行多次检测。目前最高检测灵敏度已经达到低飞克(femto)级别,成为安全且灵敏度最高的wb检测方法。
ecl
在许多研究人员心目中的几乎成为化学发光法的代名词,也是文章的保证之一。一般含有鲁米诺、h2o2和发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被hrp
和h2o2氧化,产生荧光,这个过程被发光增强剂加强。其中,增强剂在体系中扮演着核心角色,决定着ecl
化学发光的发展。化学发光的常见问题主要是抗体浓度过高,所以抗体用量要比规定的稀释倍数放大,确保不会因为hrp过量导致底物过快消耗完而引起结果不稳定。
ap
ap
作为一种经典常用的显色交联酶,自有其优点,如ap的底物显然更稳定。ap显色的灵敏度已经可以达到低pg级,但前提是封闭要做得好。常用的ap包括bcip(5-
溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐)、nbt(四唑硝基蓝)和int (硝基四紫唑),以及它们之间的组合使用,如表2。
这其中,bcip/nbt是碱性磷酸酶最佳的底物组合之一,其灵敏度最高,显色比较锐利,成像性也比较好,因此最常被用到。
各种显色方法均有其优缺点和适用范围,上面这些介绍让大家对各种产品的优点缺点一览无遗,希望这些内容可以给大家带来帮助,早日成为一个wb 高手。当然,还要提醒大家,注意操作时佩戴手套,部分显色试剂有毒性,避免与皮肤直接接触,记得用后及时彻底冲洗。
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