免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)又称荧光抗体技术,是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合,利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
一、传统的免疫荧光实验步骤
(一)、实验材料
细胞样品
试剂、试剂盒:多聚甲醛、70 % 甲醇、丙酮、PBS、Triton 、BSA、DAPI 染液、DABCO、Tris、甘油
仪器、耗材:玻片
(二)、实验步骤
细胞爬片免疫荧光实验步骤:
第一天:
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用 PBS 浸洗 3 次,每次 3 min。
2. 用 4 % 的多聚甲 Quan 固定爬片 15 min, PBS 浸洗玻片 3 次,每次 3 min。
3. 0.5 % Triton X-100( PBS 配制 ) 室温通透 20 min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤)。
4. PBS 浸洗玻片 3 次,每次 3 min,吸水纸吸干 PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室温封闭 30 min。
5. 吸水纸吸掉封闭液,不洗,每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒,4 ℃ 孵育过夜。
第二天:
6. 加荧光二抗:PBST 浸洗爬片 3 次,每次 3 min,吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中 20~37 ℃ 孵育 1 h,PBST 浸洗切片 3 次,每次 3 min;注意:从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7. 复染核:滴加 DAPI 避光孵育 5 min,对标本进行染核,PBST 5 min × 4 次洗去多余的 DAPI。
8. 用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,然后在荧光显微镜下观察采集图像。
二、传统免疫荧光实验主要问题
爬片效果欠佳
细胞和试剂用量大,成本高
染液分布不均
操作繁琐, 费时费力
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