凝胶电泳操作注意事项:
1. 缓冲系统:在没有离子存在时,电导率最小,DNA不迁移,或迁移极慢,在高离子强度的缓冲液中,电导很高并产热,可能导致DNA变性,因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时,常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。
2. 琼脂糖:不同厂家、不同批号的琼脂糖,其杂质含量不同,影响DNA的迁移及荧光背景的强度,应有选择地使用。
3. 凝胶的制备:凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致,溶解的凝胶应及时倒入板中,避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡,影响电泳结果。
4. 样品加入量:一般情况下,0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定,过多的量会造成加样孔超载,从而导致拖尾和弥散,对于较大的DNA此现象更明显。
5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移,加入DNA标准参照物进行判定是必要的。
6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。
7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度,迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。
琼脂糖加样时候注意事项:
1、 用移液抢将样品加至点样孔。每孔点样的体积一般少于25ul,因此吸取每一个样品时,操作要稳当且细心。
2、 常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度,以使每个样品停留在各自的点样孔中。
3、 在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料(如溴酚蓝),用以看出样品移动的距离。
4、 在一个或几个孔中加入标准分子质量样品,电泳结束后,根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。
5、 电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间,电泳槽盖要安全盖好,以防止液体蒸发,又可以降低电击的可能性。
6、 电泳结束后,将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭(EB)中,5min后即可看到DNA带,EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NDA结合。另一种方法是电泳时,在胶中加入EB。
7、 在紫外灯下,由于EB发出强烈的橘红色的荧光,所以可以看到DNA带。利用这种方法检测的界限是每条带约10ng DNA。带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。同样,利用特制的照相机和调焦器,也可以对凝胶拍照。
8、 如果要对某一条带(如质粒)进一步分析,可用小刀将含该带的凝胶切割下来,从带中回收DNA。
琼脂糖核酸电泳实验操作流程
1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净,放在制胶平板上,封闭模具边缘,架好梳子;
2.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶:准确称量琼脂糖干粉,加入到配胶用的三角烧瓶内,定量加入电泳缓冲液(一般20~30 ml);
3.放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻,加入一滴荧光染料,轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液,倒入电泳槽中,待其凝固;
4.室温下30~45分钟后凝胶完全凝结,小心拔出梳子,将凝胶安放在电泳槽内;
5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液,其量以没过胶面1mm为宜,如样品孔内有气泡,应设法除去;
6.在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液(loading buffer),混匀后,用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内;
7.接通电源,红色为正极,黑色为负极,切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60~100V电压,电泳20~40min即可;
8. 根据指示剂泳动的位置,判断是否终止电泳;
9.电泳完毕,关上电源,在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置,并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。
琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最jia分辨范围
0.5%1,000~30,000
0.7%800~12,000
1.0%500~10,000
1.2%400~7,000
1.5%200~3,000
2.0%50~2,000
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