在细胞复苏过程中,有多次复苏失败,最终在查阅了相关技术积累了足够的复苏技能后复苏成功,现将细胞复苏的操作程序和注意事项总结如下,望能为实验人提供些参考。
材料
1.常规细胞培养仪器设备、恒温水浴振荡器。
2.培养液(DMEM)胎牛血清(CBS)二甲基亚砜(DMSO)。
操作程序
1.细胞实验室进行常规消毒,紫外照射40min以上。
2.培养液(DMEM)、0.25%胰蛋白酶(Trypsin)恒温水浴箱370C预热20min,备用。
3.二甲基亚砜(DMSO)在4度冰箱中冷藏30min,备用。
4.从液氮保存罐中取出冻存管,立即放入40度水浴中,快速摇晃,直至冻存液完全融化。
5.将细胞悬液移入15ml离心管,缓慢加入4ml培养液,离心(1000r/min,5min)。
6.用培养液悬液混悬沉淀细胞,调整细胞浓度,放培养箱中培养。
7.记录复苏日期。
注意事项
1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套,护目镜。此项尤为重要,细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸。
2.
冻存液的问题:冻存液的配置已是常识,在这里不作详述,但二甲基亚砜(DMSO)对细胞不是完全无毒副作用,在常温下,二甲基亚砜对细胞的毒副作较大,因此,必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢,会造成细胞的损伤,二甲基亚砜(DMSO)最好选择进口产品。
3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高,注意加入少量培养液可稀释其浓度,以减少对细胞的损伤。
4.
离心问题:目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养,第二天换液。因为离心的目的是两个,去除DMSO,去除死细胞,这个是标准流程,但对一般人来说,把握不好离心转速和时间,转的不够活细胞沉底的少,细胞就全被扔掉了,转过了活细胞会受压过大,死亡。此外在操作过程中容易污染,所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜(DMSO),DMSO对细胞有一定的毒副作用,所以须将离心后的液体前倒净,且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏,结果无异常。
5. 细胞贴壁少的问题:教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml-15m培养液,而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。
6. 复苏细胞分装的问题:试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中,分装过多,细胞浓度过低,不利于细胞的贴壁。
7.
加培养基的量放入问题:这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度,从如果你加培养基的太少,那么DMSO的浓度就会比较大,就会影响细胞生长,从以前的资料来看,DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响,还有一个说法是1%。所以如果你的冻存液的浓度是10%DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。
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