PCR扩增后一般进行琼脂糖凝胶电泳分析,电泳后一般有以下几种条带:
1、引物带。引物浓度过高或是扩增效率不是特别高时都会有,一般不呈现为细带,为发散状;如果目的扩增产物带和引物带都很亮,可以考虑适当降低引物量。
2、引物二聚体带。比引物跑得慢一点,条带清晰,但如果扩增产物小于100bp时,产物与引物二聚体就不好分别了,建议采用DNA聚丙烯/酰胺电泳(不是蛋白质的SDS聚丙烯/酰胺电泳);如果引物二聚体在优化复性温度后仍然严重影响目的产物的扩增,优先考虑更换引物设计(因为引物合成的成本比反复优化条件的成本低)
3、目的扩增产物带。其大小与设计大小相同,条带清晰。
4、非特异扩增产物带。其大小与设计大小不相同,条带清晰。一般考虑通过提高复性温度来减少或消除(也可用温度梯度功能来寻找zui佳的复性温度,东胜龙811型PCR仪就有此功能)。如果其片段大小比目的片段大较多,可以通过减少延伸时间来减少或消除(即不给它足够的延伸时间)。还有一种非特异扩增产物带是来自于逆转录PCR实验时的基因组DNA的污染,如果目的扩增产物中有内含子,扩增产物很可能大于目的基因。这种条带通过优化复性温度是不能消除的,可以在逆转录前用无RNA酶的DNA酶进行样本处理。
5、模板DNA带。模板浓度过高时可能出现。如果是基因组DNA为模板,条带可能会很乱且较大。一般进行PCR扩增时,模板浓度都不要太大,否则会产生一些比目的基因长一点的杂质DNA(可能不成条带,也看不到),这是由PCR扩增原理造成的。
那么我们该如何判断是否扩增成功呢?
首先要点Marker的,对照Marker的条带,看你扩增出的条带的大小,是否跟你预计的条带大小一致,以此来判断你的PCR反应是否成功。
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