无血清培养基的组成和作用介绍

上海远慕生物科技有限公司

2023/06/19 10:26

在细胞培养中大多数动物细胞体外培养时都需要加入血清提供营养，但由于血清存在很多潜在风险，促使科学家们进行无血清驯化细胞的研究。所以，在1976 年Hayashi 等人提出了无血清培养基的概念，此后，大量生物医药学家开始对无血清培养基进行研制。80 年代后，无血清培养基的研究与制备广泛发展，到 90 年代已有一些商业化无血清培养基。与传统的培养基相比较，无血清培养基是不含动物血清，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、增殖的一种培养基。无血清培养基由于其组成成分相对清楚，制备过程简单，在现代生物技术学领域得到广泛应用。

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无血清培养基的组成和作用

1.葡萄糖
动物细胞培养基中添加的糖主要是葡萄糖，添加量通常在5-25mM之间。葡萄糖的主要代谢途径是通过糖酵解代谢成丙酮酸，进而降解成乳酸。这最终会导致乳酸在培养基中积累。代谢流研究分析发现，只有一小部分（约20-30%）的葡萄糖流向其它途径包括三羧酸循环和戊糖磷酸旁路。
除了葡萄糖，研究发现，动物细胞也能利用谷氨酰胺作为主要的能量物质。谷氨酰胺的添加量常常高于其它氨基酸（2-4mM），也是很多细胞系生长需要的物质。在大多数情况下，谷氨酰胺和葡萄糖会分别被快速利用，在耗尽之前，会引起细胞生长抑制。

2.氨基酸
细胞不同，所需的特定营养也不同，同理，它们所需的必需氨基酸（动物体内不能自身合成）也是不同的。一些非必需氨基酸通常也会加入到培养基中，这是因为有些细胞系自身不能产生相应的氨基酸，从而会限制细胞生长。培养基中氨基酸限制会降低细胞生长速率和/或最高细胞密度。其它非必需氨基酸细胞可以产生，但是不足以维持最优生长。一些氨基酸如谷氨酰胺在培养基中不稳定，因此需要单独加入以维持其在一个合适的浓度水平。
支链氨基酸被很多细胞包括MDCK细胞、人成纤维细胞、小鼠骨髓瘤细胞和BHK细胞等消耗得特别快。研究发现，当杂交瘤细胞利用谷氨酰胺利用率很低的时候，支链氨基酸被氧化的更多。同样，谷氨酰胺的消耗降低，丝氨酸的消耗就会升高。

一些细胞系对氨基酸限制比其它细胞要敏感，因此，在大规模培养基中，补料策略非常重要。例如，谷氨酰胺浓度低，BHK细胞就会消耗更多的其它氨基酸，尤其是必需氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸和非必需氨基酸如丝氨酸和谷氨酸盐。

3.盐
为防止渗透压失衡，培养基的盐浓度需与渗透压匹配。培养基细胞生长标准渗透压是300mOsm/kg，这个渗透压适用于绝大多数细胞。值得注意的是，由于盐会改变培养基的渗透压，因此，向培养基中加盐的时候要特别小心。大多数细胞能承受的渗透压范围在270~330mOsm/kg。
经常用的盐有Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO42-、PO43-和HCO3-。它们几乎出现在所有的基础培养基中。

4.微量元素
培养基中添加了血清含有的无机微量元素，如Mn、Cu、Zn、Mo、Va、Se、Fe、Ca、Mg、Si、Ni和不常用的微量元素如Al、Ag、Ba、Br、Cd、Co、Cr、F、Ge、J、Rb和zr。这些微量元素激活酶的活性，也是大多数细胞生长所需的元素。

无血清培养基中经常添加的元素是硒。硒的主要功能是抗氧化和促进细胞生长，硒以硒蛋白家族形式在动物细胞中发挥生理作用，目前已被确认的形式有11种，据研究，这些蛋白均参与抗氧化活动，如谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白酶。

在某些情况下，特定微量元素的加入会降低对某种生长因子的需求。例如，在很多细胞如B淋巴细胞、MDCK和人二倍体成纤维细胞中，亚铁盐能够替代转铁蛋白。

研究发现，钙参与细胞增殖活动，这对于很多过程如信号转导、细胞分裂和细胞黏附等过程很重要。钙调蛋白（一种钙激活蛋白）通过不同的浓度水平调节细胞分裂过程中的很多丝氨酸/苏氨酸激酶活性。钙浓度升高，对很多细胞如角质形成细胞和人二倍体成纤维细胞生长有利。降低培养基中的钙浓度，就会降低细胞间的黏附。在很多生产系统中，细胞结团是一个大问题，这会降低产量和细胞存活率。如降低培养基中的钙浓度，则可以避开这个问题的产生，而且这在很多搅拌培养系统中被证明十分有效。

5.维生素
培养基中的维生素和荷尔蒙浓度相对较低，它们被作为辅助因子利用，不同细胞系对它们的营养需求存在很大不同。因此，这些辅助因子在不同的培养基中变化很大。维生素对细胞的限制表现在细胞生长和存活上，但不影响最高细胞密度。

培养基中的维生素水平随细胞种类的不同而不同。基础培养基配方如为HeLa细胞和小鼠成纤维细胞而设计的BME培养基含有生物素、叶酸、尼可酰胺、泛酸盐、吡哆醛、核黄素和硫胺。无血清培养基配方越复杂，例如F12、DMEM、M199，它含有的维生素种类就越多。每种维生素的含量都是根据具体的细胞系靠经验添加。因此，每种培养基都需要根据不同的情况而设计。

6.缓冲盐
在细胞培养过程中，HCO3-经常和二氧化碳环境（5-10%）配合使用作缓冲系统，这使得培养基的pH普遍维持在6.9-7.4，在培养箱或者摇瓶中，通过控制气体控制CO2，HCO3--CO2缓冲系统的缺点在于，离开CO2的环境，培养基迅速变为碱性。为防止这种情况发生，有机缓冲液Hepes（pH7.0）经常以~25mM的浓度加入培养基，这使得CO2的浓度可以降低至2%

7.生长因子
为促进细胞生长，经常在一些培养基中添加特定蛋白，在无血清或低血清的培养基中，这些蛋白能够为细胞生长提供基础物质。他们被称为“生长因子”。

这类生长因子包括成纤维细胞生长因子（酸性FGF和碱性FGF）、类胰岛素生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、神经生长因子（NGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）和转化生长因子（TGF：α和β）。这些生长因子在1-10ng/mL的范围内均有活性。

8.脂类
在细胞内，脂类有很多作用。它们是细胞膜、外部信号传感器的组件，也是能量代谢之源。血清本身含有脂类，但是基础培养基配方通常不含脂类。某些脂类作为添加剂添加到无血清培养基中，显示有促进细胞增殖的作用。

通常，血清中的脂类有脂肪酸、磷脂、卵磷脂和胆固醇。磷脂不但是细胞膜的主要构成组件，在调节生长的信号传导途径中也起到非常重要的作用。在细胞外，磷脂对很多细胞系的生长起促进作用。在很多贴壁细胞如MDCK、小鼠上皮细胞和其它肾细胞中，磷脂酸和溶血磷脂酸能促进它们生长。在无血清培养基中，其它脂类如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇可以促进人二倍体成纤维细胞的生长。胆固醇对大多数细胞也有促进生长作用，也是某些细胞（如骨髓瘤细胞）生长的必需成分。其它一些特定的脂肪酸，如油酸和亚油酸，在杂交瘤细胞的无血清培养的传代中也能提高生长速度和产量。

无血清培养基的优势
1.可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。
2.避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。
3.避免血清组分对实验研究的影响。
4.有利于体外培养细胞的分化。
5.可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。

无血清培养基的缺点
1.细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。
2.成本较高。
3.针对性很强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。

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