WB试验中常用细胞裂解液及酶抑制剂介绍

上海远慕生物科技有限公司

2023/07/21 10:00

1、细胞裂解液

细胞裂解液作用：

(1) 利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；

(2) 溶解蛋白；

(3) 蛋白变性使其稳定；

(4) 抑制蛋白酶活性。

细胞裂解成分一般使用的是表面活性剂，常用的有曲拉通X-100（Triton X-100）、脱氧胆（deoxycholate）、乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P40，NP-40）、十二烷基磺酸钠（SDS）。其中Triton X-100和NP-40为非离子型，deoxycholate和SDS为离子型。不同裂解成分的裂解强度不同，一般来说Triton X-100和SDS的裂解能力较强，deoxycholate和NP-40的裂解效果较为温和，可以根据不同的实验需求选用不同的裂解液。

2、蛋白酶抑制剂

破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。蛋白酶抑制剂（protease inhibitor）从广义上指与蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合，使蛋白酶活力下降，甚至消失，但不使酶蛋白变性的物质。各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。

常用的蛋白酶抑制剂和各自作用特点如下：

(1) 苯甲酰磺酰氟（PMSF）：抑制丝氨酸蛋白酶（如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；

(2) 乙二胺四乙酸（EDTA）：作为螯合剂可逆抑制金属蛋白水解酶；

(3) 胃蛋白酶抑制剂（pepstantin）：抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管紧张肽原酶，组织蛋白酶D和凝乳酶；

(4) 亮抑蛋白酶肽（leupeptin）：可逆抑制丝氨酸、半胱氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶，如木瓜蛋白酶，血浆酶和组织蛋白酶B；

(5) 胰蛋白酶抑制剂（aprotinin）：竞争性可逆抑制丝氨酸蛋白酶，如血浆酶，血管舒缓素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶；

(6) AEBSF：一种水溶性的丝氨酸蛋白酶不可逆抑制剂，其抑制常数与PMSF和DFP的抑制常数相似，可以有效抑制胰蛋白酶（trypsin）、糜蛋白酶（chymotrypsin）、纤溶酶（plasmin）、激肽释放酶（kallikrein）和凝血酶（thrombin）等蛋白酶，作为PMSF和DFP的替代物，AEBSF的毒性更低、水溶性和水溶液稳定性更好。

(7) 乌苯美司（I Ubenimex，NN，也称为bestatin）：竞争性，可逆的氨基肽酶抑制剂，对精氨酰氨基肽酶（氨基肽酶B），白三烯A4水解酶（显示环氧化物水解酶和氨基肽酶活性的锌金属蛋白酶），丙氨酰氨基肽酶（氨肽酶M /N），亮氨酰/胱氨酰氨基肽酶（催产素/血管加压素酶）（白三烯D4水解酶）有抑制作用；

(8) N-（反式-环氧丁二酰基）-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺（E64）：半胱氨酸蛋白酶不可逆抑制剂；

(9) 胃酶抑素A（Pepstatin A）：天冬氨酸蛋白酶可逆抑制剂。

3、磷酸酶抑制剂

细胞或组织裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，以各种方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化，从而影响后续的蛋白检测。因此在提取物中适量添加外源性磷酸酶抑制剂，有利于在之后的Western blotting、免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质和蛋白激酶活性测定等实验过程中抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，维持蛋白质的磷酸化状态。

常见的磷酸酶有蛋白酪氨酸磷酸酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶，常用的磷酸酶抑制剂如下：

(1) 氟化钠（sodiμm fluoride）：酸性磷酸酶可逆抑制剂；

(2) 焦磷酸钠（sodiμm pyrophosphate）：丝氨酸/苏氨酸磷酸酶不可逆抑制剂；

(3) β-甘油磷酸（β-glycerophosphate）：丝氨酸/苏氨酸磷酸酶可逆抑制剂；

(4) 正钒酸钠（sodiμm orthovanadate）：碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶可逆抑制剂：

(5) 钼酸钠（sodiμm molybdate）：酸性磷酸酶不可逆抑制剂；

(6) 二水酒石酸钠（sodiμm tartrate dihydrate）：酸性磷酸酶可逆抑制剂；

(7) 咪唑（imidazole）：碱性磷酸酶可逆抑制剂。

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