1. 取过夜菌至50毫升离心管内,5000g离心1分钟收集细菌沉淀,弃上清。再重复一次,每管共收集100毫升过夜菌沉淀。
通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2-4。建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心1分钟,如沉淀不充分则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密,不利于加入溶液I后散开沉淀。直接倒掉上清,再倒入约50毫升菌液并重复上述操作,然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸),使液体流尽。如果细菌密度明显偏低,可考虑使用更多菌液,再重复上述操作1-2次。对于高拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过150毫升,对于低拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过200毫升。过量的细菌会导致后续的裂解不充分。
2. 每管加入5毫升溶液I,重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开,无可见细菌团块。
确认溶液I中已添加了RNase A。最高速度vortex 10-20秒或更长时间,悬起沉淀。一定要充分混匀,对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液,无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex,可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开,或手指把沉淀弹开。
3. 每管加入5毫升溶液II,轻轻颠倒离心管4-6次,室温放置1-2分钟,使细菌完全裂解,溶液透明。
切勿vortex!vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂,易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。颠倒4-6次后,溶液应变得透明,无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有完全散开,那么颠倒4-6次后,可能还会有团块或絮状物。遇到有少量团块或絮状物产生的情况,可以增加颠倒次数3-5次,再室温放置2-3分钟,但总裂解时间不可超过5分钟。
4. 每管加入7毫升溶液III,随即颠倒离心管4-6次混匀,可见白色絮状物产生。
切勿vortex!颠倒次数也不宜过多,否则易导致最终所得质粒的质量下降。
5. 12,000-14,000rpm)室温离心10分钟。
如果离心机的最高速度较低,需要适当延长离心时间,例如约5000-6000rpm时需要离心20-30分钟或更长时间,直至沉淀充分。离心时可以准备好质粒纯化柱,自制漏斗等,并在纯化柱上标上记号。
6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。12,000-14,000rpm离心2分钟,倒弃收集管内液体。
质粒倒入质粒纯化柱后,可以不用等待,直接离心。倒弃收集管内的液体后,保留收集管继续使用。本步骤及后续需要12,000-14,000rpm离心2分钟的步骤,如果离心机的最高速度较低,需要适当延长离心时间,例如约5000-6000rpm时需要离心约5分钟或更长时间,直至液体全部穿柱。如果离心后有少量漂浮物,可以考虑再次离心,或者使用擦镜纸两次对折后打开形成的自制漏斗,以过滤去除漂浮物。
7. 在质粒纯化柱内加入12毫升溶液IV,12,000-14,000rpm离心2分钟,洗去杂质,倒弃收集管内液体。
加入溶液IV后可以不用等待,直接离心。倒弃收集管内的液体后,保留收集管继续使用。
8. 12,000-14,000rpm再次离心2分钟,除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。
注意:倒弃收集管内液体后再离心,才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。
9. 将质粒纯化柱置于50毫升离心管上,加入2毫升溶液V至管内柱面上,放置2分钟。
也可以用重蒸水或MilliQ级纯水替代溶液V,但是水的pH应不小于6.5。溶液V加入后放置时间稍长,对于增加质粒产量会略有帮助。如想得到较高浓度的质粒,可以加入1毫升溶液V洗脱,质粒得率实测减少约5-10%,具体减少量与特定样品有关。
10. 12,000-14,000rpm离心2分钟,所得液体即为转细胞级超纯质粒。
通常所得质粒浓度为0.1-0.3mg/ml左右,可以用于细胞转染。如果想得到高浓度的质粒,可以采用如下的异丙醇沉淀方法浓缩质粒或常规的乙醇沉淀方法。
a. 加入0.7倍体积的常温异丙醇(例如1毫升待浓缩质粒中加入0.7毫升异丙醇),混匀后1,2000-14,000rpm 4℃离心10分钟,小心吸去上清液,避免触及沉淀。
如果希望获得较高浓度的质粒,在洗脱时推荐采用1毫升洗脱液进行洗脱,后续可以转移到2毫升离心管内进行异丙醇沉淀,这样操作起来相对比较方便。异丙醇沉淀的DNA为玻璃状近透明的颗粒状沉淀,和乙醇沉淀产生的含盐沉淀物相比较难观察清楚。离心后取放离心管要尽量轻柔,避免沉淀松动或部分颗粒状悬浮至溶液中。不推荐直接倒弃上清,直接倒弃上清时经常出现直接把质粒沉淀倒掉的情况;如果偏好直接倒弃上清,建议把上清倒弃至一洁净离心管内,这样万一沉淀被倒出,仍然可以从洁净离心管中回收。推荐用移液枪吸去上清,并注意尽量避免吸走沉淀。
b. 加入1毫升常温70%乙醇溶液,轻轻悬起质粒沉淀以充分洗涤,12,000-14,000rpm 4℃离心5-10分钟,小心吸去上清液,避免触及沉淀。
c. 5,000-10,000rpm 4℃离心5-10秒,用20微升或200微升移液器小心吸净残留液体,避免触及沉淀。
d. 肉眼观察无明显液体后(吸净液体后通常在1分钟内即可完成干燥),加入适当体积的溶液(如溶液V、10mM Tris-Cl pH8.5或Milli-Q级纯水)溶解DNA。
DNA样品不能过于干燥,否则很难溶解。最好在弱碱性条件下溶解DNA,溶解时可用缓冲液反复冲洗管壁,使管壁上的DNA充分溶解。
附表1. EndA- and EndA+ strains of E. coli.
EndA- EndA+
BJ5183 BL21(DE3)
DH1 CJ236
DH20 HB101
DH21 JM83
DH5α JM101
JM103 JM110
JM105 LE392
JM106 MC1061
JM107 NM522 (all NM series are EndA+)
JM108 NM554
JM109 P2392
MM294 PR700 (all PR series are EndA+)
SK1590 Q358
SK1592 RR1
SK2267 TB1
SRB TG1
TOP10 Y1088 (all Y10 series are EndA+)
XL1-Blue BMH 71-18
XLO ES1301
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