方案摘要
方案下载应用领域 | 生物产业 |
检测样本 | 其他 |
检测项目 | |
参考标准 | RNA提取 |
掌握RNA提取的基本技术,了解RNA提取过程中的各种注意事项。 二、原理 RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。
一、目的
掌握RNA提取的基本技术,了解RNA提取过程中的各种注意事项。
二、原理
RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。
RNA提取和DNA提取有类似的地方,因为它们都是核酸,都具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞,然后用提取液将RNA溶出,反复抽提去除蛋白质,加入乙醇沉淀RNA,将RNA沉淀溶解备用。那么如何区分DNA和RNA分开?DNA和RNA的溶解性不同,DNA在1M的盐溶液中具有最HAO的溶解度,而RNA在0.14M的盐溶液中具有最HAO的溶解度,所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。另外,RNA的分子量一般比较小,而DNA分子很大且和蛋白结合成复合体,所以DNA更容易随蛋白沉淀,而RNA具有较好的溶解性。
RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180℃×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1%的DEPC水37℃过夜浸泡,然后湿热灭菌80℃烘干备用。配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水,而配置Tris相关的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应,应避免用DEPC处理。另外操作过程中应戴手套。
判断RNA 的质量主要有两个标准,一是纯度,二是完整性(是否被降解)。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260/A280值来判断。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明,未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条带(如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带)。RNA电泳系统也要严格对RNA酶进行处理。如果用普通琼脂糖凝胶电泳,则用尽量减少电泳时间。
三、试剂与器材
(一)试剂
1、暗培养7天的小麦苗,用前光照诱导3 h
2、DEPC
3、DEPC处理的ddH2O
4、RNA提取液:(每1000毫升中含有)
Tris 6.06 克 (最终浓度为50 mM )
LiCl 6.03 克 (LiCl -H2O9.06克) (最终浓度为150 mM )
EDTA(0.5 M) 10 毫升 (最终浓度为5 mM )
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