方案摘要
方案下载应用领域 | 石油/化工 |
检测样本 | 其他 |
检测项目 | |
参考标准 | PCR扩增是模拟天然DNA复制过程,利用DNA聚合酶在体外(试管中)扩增一对引物之间特异性DNA片段的方法。 |
实验原理:PCR扩增是模拟天然DNA复制过程,利用DNA聚合酶在体外(试管中)扩增一对引物之间特异性DNA片段的方法。其主要热循环过程可分为三个步骤: (1)高温变性(denature):提供DNA复制的有效模板。 (2)低温退火(anneal):引物与模板DNA复性,提供游离3’-OH端供DNA复制起始; (3)中温延伸(extend):依赖Mg2+,DNA聚合酶催化合成与模板互补的新的DNA分子。
实验原理:PCR扩增是模拟天然DNA复制过程,利用DNA聚合酶在体外(试管中)扩增一对引物之间特异性DNA片段的方法。其主要热循环过程可分为三个步骤:
(1)高温变性(denature):提供DNA复制的有效模板。
(2)低温退火(anneal):引物与模板DNA复性,提供游离3’-OH端供DNA复制起始;
(3)中温延伸(extend):依赖Mg2+,DNA聚合酶催化合成与模板互补的新的DNA分子。
以上变性、退火、延伸三个过程组成一个循环周期;常循环25~40周期,经过n轮循环后,靶DNA的拷贝数理论上呈2n增长;循环进行完毕,通常zui后还在DNA聚合酶zui适温度下延伸5~10分钟。
操作步骤:本次实验程序如下:
(1)标记一个洁净的200uL反应管,向其中依次加入:
ddH2O 36 uL
10×PCR反应缓冲液 5uL
2mmol/L dNTPs 5uL
上游引物 1uL
下游引物 1uL
DNA模板 1uL
Taq DNA聚合酶 1 uL
总体积:50uL
混合均匀后,盖紧管盖,离心5S,使反应成份均匀富集于管底。
(2) 加石蜡油50~100μl于反应液表面以防蒸发(此步骤根据PCR仪而定,如带高温热盖PCR仪不需加入)。
(3) 在PCR仪上设置反应循环参数,本次实验为:94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 30s,循环数为30,zui后于72℃充分延伸10 min后终止反应(16℃ 3 min)。
(4) 置反应管于PCR仪上进行热循环。
(5) 反应完毕后,常取5~10%反应产物(如本次5uL)进行琼脂糖凝胶电泳,通过溴乙锭染色,在紫外灯下观察扩增产物的质量,正常DNA电泳带应清晰、整齐,并通过与已知分子量大小的DNA标志物比较,初步了解产物大小是否与预期吻合。
注意事项:
1. 戴手套操作,避免污染
2.冰上操作
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