聚合酶链式反应及其产物分析

2019/07/02   下载量： 0 次

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应用领域 石油/化工
检测样本 其他
检测项目
参考标准 PCR扩增是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合酶在体外（试管中）扩增一对引物之间特异性DNA片段的方法。

实验原理：PCR扩增是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合酶在体外（试管中）扩增一对引物之间特异性DNA片段的方法。其主要热循环过程可分为三个步骤： 　　 （1）高温变性（denature）：提供DNA复制的有效模板。 　　 （2）低温退火（anneal）：引物与模板DNA复性，提供游离3’-OH端供DNA复制起始； 　　 （3）中温延伸（extend）：依赖Mg2+，DNA聚合酶催化合成与模板互补的新的DNA分子。

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实验原理：PCR扩增是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合酶在体外（试管中）扩增一对引物之间特异性DNA片段的方法。其主要热循环过程可分为三个步骤：

　　 （1）高温变性（denature）：提供DNA复制的有效模板。

　　 （2）低温退火（anneal）：引物与模板DNA复性，提供游离3’-OH端供DNA复制起始；

　　 （3）中温延伸（extend）：依赖Mg2+，DNA聚合酶催化合成与模板互补的新的DNA分子。

　　以上变性、退火、延伸三个过程组成一个循环周期；常循环25～40周期，经过n轮循环后，靶DNA的拷贝数理论上呈2n增长；循环进行完毕，通常zui后还在DNA聚合酶zui适温度下延伸5～10分钟。

操作步骤：本次实验程序如下：

　　（1）标记一个洁净的200uL反应管，向其中依次加入：

　　　　ddH2O 36 uL

　　　　10×PCR反应缓冲液 5uL

　　　　2mmol/L dNTPs 5uL

　　　　上游引物 1uL

　　　　下游引物 1uL

　　　　DNA模板 1uL

　　　　Taq DNA聚合酶 1 uL

　　　　总体积：50uL

　　 混合均匀后，盖紧管盖，离心5S，使反应成份均匀富集于管底。

　　（2） 加石蜡油50～100μl于反应液表面以防蒸发（此步骤根据PCR仪而定，如带高温热盖PCR仪不需加入）。

　　（3） 在PCR仪上设置反应循环参数，本次实验为：94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，循环数为30，zui后于72℃充分延伸10 min后终止反应（16℃ 3 min）。

　　（4） 置反应管于PCR仪上进行热循环。

　　（5） 反应完毕后，常取5～10％反应产物（如本次5uL）进行琼脂糖凝胶电泳，通过溴乙锭染色，在紫外灯下观察扩增产物的质量，正常DNA电泳带应清晰、整齐，并通过与已知分子量大小的DNA标志物比较，初步了解产物大小是否与预期吻合。

 

注意事项：

　　 1. 戴手套操作，避免污染

　　　2．冰上操作

 

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上海远慕生物科技有限公司
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