方案摘要
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一般情况下提取的RNA已经足够,而且在逆转录过程中RNA的质量要远较RNA的数量更重要,一般仅取上清的上1/2左右足矣,这样可最大限度避免对于中间蛋白相的扰动
从冻存的细胞提取RNA
1). 将冻存管从液氮或冰箱中取出;
2). 不待细胞溶解,将Trizol500ul-1ml直接放入冻存管中,此时Trizol会冻成冰状;
3). 将冻存管缓慢融化,并用加样器吹打混匀;
4). 将细胞裂解液移至Eppendorf管中,16000′g离心1min,吸出管底絮状沉淀;
注释:该步骤并非必要,多数Protocol省略该步骤,但加入该步中能明显提高RNA的质量;注意不能离心时间过长,否则沉淀难以吸出,将200ul黄枪头尖部切去0.5cm操作;
5). 加入1/5体积的氯仿(约200ul),上下颠倒2~3min;
6). 4℃ 16000′g离心15min,轻轻吸出上清至新的Eppendorf管(约700ul ),不要扰动中间层或用手指使Eppendorf管变温;
注释:一般情况下提取的RNA已经足够,而且在逆转录过程中RNA的质量要远较RNA的数量更重要,一般仅取上清的上1/2左右足矣,这样可最大限度避免对于中间蛋白相的扰动;
7). 加入等体积异丙醇(约800ul),充分混匀,冰上静置15min;
8). 4℃ 16000′g离心15min,轻轻倒掉上清,仅留管底沉淀;
9). 加入1ml预冷的无水乙醇,4℃ 16000′g离心2min,轻轻倒掉上清,仅留管底沉淀;
10). 倒置Eppendorf管于干净滤纸上,至可见乙醇完全挥发;
11). 用100ul 新鲜制备的DEPC处理过的MilliQ 水溶解RNA,如果溶解不好,-20℃反复冻融1~2次,4℃ 16000′g离心3min,将上清吸至新的Eppendorf管中;
12). 加入等体积12 M LiCl,-20℃静置15min;
13). 4℃ 16000′g离心15min,轻轻倒掉上清,仅留管底沉淀;
注释:该步骤的目的在于去除小分子降解RNA和盐分;但可以省略;只有大分子RNA在高浓度LiCl中沉淀,DNA不会沉淀;
14). 加入1ml预冷的无水乙醇,4℃ 16000′g离心2min,轻轻倒掉上清,仅留管底沉淀;
注释:该步的目的在于去除LiCl,LiCl溶于乙醇,而RNA不溶于乙醇,利用溶解度分离;
15). 倒置Eppendorf管于干净滤纸上,至可见乙醇完全挥发RNA边缘呈半透明;
16). 用40ul新鲜制备的DEPC处理过的MilliQ 水溶解RNA;
17). 取出5ul 用于紫外分光光度计测定和琼脂糖凝胶电泳,其余冻存-70℃。
注释:如果OD260/OD280<1.8,则加入等体积Trizol,按上述步骤重新提纯。
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