核酸检测常态化，遇到“假阳性”解决方法

2024/09/29   下载量： 0 次

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实时荧光RT（real-time）-PCR，即实时荧光反转录聚合酶链式反应。它首先将提取的病毒基因组RNA，通过反转录变成DNA（cDNA）。然后再用病原体特异性的引物，以cDNA作为模板扩增病原体核酸序列。因为扩增的过程中荧光染料能同步整合在产物上，所以研究者可以通过荧光信号的强弱，进行实时检测。

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实时荧光RT（real-time）-PCR，即实时荧光反转录聚合酶链式反应。它首先将提取的病毒基因组RNA，通过反转录变成DNA（cDNA）。然后再用病原体特异性的引物，以cDNA作为模板扩增病原体核酸序列。因为扩增的过程中荧光染料能同步整合在产物上，所以研究者可以通过荧光信号的强弱，进行实时检测。

但在实际PCR实验过程中极易发生污染，引起检测结果的假阳性。

什么是“假阳性”？

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但作为一种高灵敏度的检测手段，也是因为过于灵敏反而容易污染，PCR的实验结果也容易被各种无关的外源性DNA或RNA所干扰，极其微量的污染也能扩增后被检出，即在本不该出现荧光信号的阴性样本、阴性对照（生理盐水）或空白对照中出现了阳性的荧光信号，可能造成假阳性的产生与阳性结果误判。

引起PCR实验室污染的原因

由于PCR技术敏感性特高，所以要求更高，影响因素也非常多，从样品开始采集到结果报告发出，任何一处细小的失误都会造成检测结果的偏差，极其微量的污染都容易导致样品出现假阳性结果。产生污染的主要途径如下：

1、标本的污染

（1） 收集标本的容器被污染；

（2） 标本放置的时候，由于密封不严溢于容器外；

（3） 容器外粘有标本造成相互间交叉污染；

（4） 标本核酸模板在提取过程中，由于加样器污染导致标本间污染；

（5） 有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。

2、试剂的污染

主要是在PCR组分试剂配制加样过程中，由于加样器、容器、双蒸水、阴性对照及其它试剂被PCR核酸模板或阳性对照污染。

3、扩增产物污染

实验室扩增产物的遗留污染是PCR实验室中最主要、最常见的污染。因为 PCR 产物拷贝量大，远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的 PCR 产物污染，就可形成假阳性。

气溶胶污染是最可能造成PCR产物污染的主要原因。在离心机离心、空气与液体面摩擦时、在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时、闭盖时，及污染加样器的反复吸样吹打都可形成气溶胶而污染。当这些气溶胶里长短不一核酸片段的小颗粒在实验室里（或移液器内）日积月累，沉降到实验台面、PCR仪、移液器、吸头盒等地方，当达到一定浓度，很可能会弥漫到样本中，最后导致PCR实验结果出现假阳性。

有哪些措施能预防实验室污染，防止假阳性的产生呢？

1．布局合理的实验室是保证实验能正常进行的前提

PCR实验室原则上至少设有试剂准备区、样品制备区，扩增区三个单独的工作区域，并设有专用走廊，各工作区域应设缓冲间。各区在空间上完全独立，不能相通。各区有独立的通风系统，扩增前和扩增后区域应具有独立通风系统，扩增后区域保持负压状态，其它区域保持正压或常压状态，防止扩增产物进入扩增前的区域，压差≥5Pa。进风口和出风口不能设在建筑的同一平面，要避免排出的空气被重新吸进实验室。

各区域只用于特定的操作，工作衣和清洁清毒物品不得跨区混用，实验室人员和物品应从试剂准备区到扩增区单向工作流动，不得逆向流动。

2．做好质量控制

实验室应建立合理、科学的室内质控标准操作规程（SOP），质控应该样本处理到报告发放全程参与，新型冠状病毒核酸检测严格执行“三个阴性样本随机放在临床标本中间同时参与检测全过程”的质控策略，以及复检规则的设置等，可有效避免假阳性结果的发生。

3. 试剂耗材的摆放

配制试剂时应正确使用加样枪，使用带滤心的枪头，尽量一次性吸完，不要反复多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶。核酸提取结束后，取下废弃试剂和耗材，用自封袋密封后放入医疗废物桶中。

4. 核酸扩增

扩增产物是最容易出现的污染，通常一次典型的PCR扩增可以产生109拷贝的靶序列，若气溶胶化，最小的气溶胶都会产生含106拷贝的扩增序列，这些气溶胶的累积会污染实验室内的试剂、仪器设备和通风设备，使检测结果出现异常[2]。因此，应对核酸扩增的每一个环节进行严格的规范操作。

（1）扩增反应液和样本核酸模板分装完毕检查管内液面高度一致后，加盖八联管盖，逐孔按紧，混匀离心后再次检查八联管有无渗漏。

（2）八联管转移至96孔扩增盘时再次确认管盖已封严，以防扩增过程中爆管导致实验室污染。

（3）扩增结束后要及时将扩增产物从扩增仪里取出（禁止打开八联管），检查管内液面无变化后放入“自封袋”内封严，然后带出扩增区，不能随便丢弃，需按医疗废物处理。

5。实验结束后的清洁消毒

清洁消毒方法不当也是实验室污染的一个主要原因，实验结束后应遵从先清洁区域后污染区域消毒的原则，及时对实验室空气、设备表面、工作台面和地面等实施有效的消毒。

（1）紫外灯

工作结束后用可移动紫外线灯进行工作台面照射；

开启超净工作台或生物安全柜内的紫外线进行照射；

夜间开启固定紫外线灯进行照射。

2）70%乙醇

每天工作开始前及工作结束后拭工作台面、设备及物品表面；

日常仪器和架子的维护清洁。

（3）0.55%次氯酸钠溶液（新鲜配置）

实验室工作台面和样本外溅时使用；

开盖机、生物安全柜等日常擦拭。

（4）PCR Cleaner（ PCR污染清除喷雾剂）

PCR Cleaner（ PCR污染清除喷雾剂）是去除实验室操作台表面DNA的即用型喷雾剂，用于去除PCR工作台、实验室机电产品、试验台表面和实验仪器设备表面上残存的核酸，能快速有效地清除DNA或RNA污染，也是PCR实验室常见的污染清除利器之一。

另外，加强实验室通风，真的非常重要！

总结下来，实验室防污染原则 预防为主，严守章程！

文献贡献者

上海远慕生物科技有限公司
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