我们从构建好的大量抗体中筛选出候选抗体,然后要注入小鼠和食蟹猴体内,在不同时间点取血清,测定其中的抗体浓度,计算抗体的pk值,以进行进一步的抗体筛选。因此要进行大量的elisa实验。
试剂:1. 双蒸水(实验室制备) 2. 包被液:碳酸盐缓冲液 na2co3 159mg nahco3 293mg ddh2o to 100ml 3. 1×pbs(实验室配置) nacl 8g kcl 0.2 kh2po4 0.27g na2hpo4 ?12h2o 3.58g ddh2o to 1l 4. pbst(实验室配置):adding 500ul tween20 into 1l 1×pbs. 5. blocking solution: 2% bsa bsa 2g 1×pbs to 100ml 6. bsa(beyotime, cat number:st023) 7. antigen (pepro tech, cat:200-04r ), dissolved in ddh2o and prepared 100ug/ml stocking solution. 8. human antibodies (mammalian cell expressed) 9. secondary antibody(hrp conjugated)(sino biotechnology, cat: ssa002. working solution:dilute secondary antibody at 1:2000 with 1% bsa . 10. tmb(solarbio,cat number:pr1200) 11. 2m 硫酸(实验室配置)
材料: 1. 15ml 离心管(nunc) 2. 96-well elisa 酶标板(jetbio) 3. 300ul 多通道移液器(rainin) 4. 10ul、200ul、1000ul 单通道移液器(rainin) 5. 1.5ml 离心管
仪器: 1. 恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司) 2. 酶标仪(md flexstation3)
方法:
1. 配制抗原包被液。
2. 将配好的抗原包被液加入到加样槽中,使用12 channel pipette (使用前需用手将每一个tip头压紧) 加入96-well 酶标板中,每孔100ul。加样时要注意避免气泡并避免液体粘附于孔壁。加样时使pipette的各个tip对准96-well一行中的各个孔,按照由b行至g行的顺序,逐行加入。
1. 将96-well酶标板用保鲜膜包裹(或加盖)后, 4℃ 冰箱中孵育过夜。
2. 第二天,将96-well 板取出,弃其中溶液,并在洁净的纸巾上轻轻拍干。
3. 使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入1×pbs,每孔300ul。
4. 室温静置3min,弃溶液,并在洁净的纸巾上轻轻拍干。
5. 重复步骤5和6,共计三次。
6. 使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入blocking solution,每孔300ul。
7. 将酶标板用保鲜膜包裹(或加盖)后,置于37℃恒温培养箱中孵育1h。(37℃ or lower?)
8. 将96-well 板取出,弃其中溶液,并在洁净的纸巾上轻轻拍干。
9. 使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入pbst,每孔300ul。
10. 室温静置3min,弃溶液,并在洁净的纸巾上轻轻拍干。
11. 重复步骤11和12,共计5次。 重复步骤5和6,共计2次。
12. ※将稀释好的抗体依次加入到相应的孔中,每个样品做三个复孔,每孔100ul。(加样方法,方向如下。)
1. 将酶标板用保鲜膜包裹(或加盖)后,置于37℃恒温培养箱中孵育1h。
2. 将96-well 板取出,弃其中溶液,并在洁净的纸巾上轻轻拍干。
3. 重复步骤11和12,共计5次。 重复步骤5和6,共计2次。
4. 使用12-channel pipette(用手将每一个tip头压紧)向96-well 板中按照加抗原包被液的方式逐排加入二抗working solution,每孔100ul。
5. 将酶标板用保鲜膜包裹(或加盖)后,置于37℃恒温培养箱中孵育1h。
6. 将96-well 板取出,弃其中溶液,并在洁净的纸巾上轻轻拍干。
7. 重复步骤11和12,共计5次。 重复步骤5和6,共计2次。
8. 确保环境温度为25℃,使用12-channel pipette(用手将每一个tip头压紧) 按照加抗原包被液的方式,向96-well 板中逐排加入tmb溶液,每孔100ul。
9. 25℃下,保温3min,立即使用12-channel pipette(用手将每一个tip头压紧) 按照加抗原包被液的方式,向96-well板中加入2m h2so4 溶液终止反应。
10. 静置5min后,将96-well板置于flexstation iii 于450nm检测读数。 (在flexstation iii的工作站软件中选择endpoint/hrp-tmb 方法)
※ 抗体稀释方法:
prepare 0.1ug/ml antibody solution;
then to prepare antibody working solution as below:
end
使用12 channel pipette (使用前需用手将每一个tip头压紧);
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