对于任何一个科研菌都不陌生。
BUT
为甚么别人的实验,时间短跑胶快?
除了实验精细化操作,
当然也离不开选择最佳的试剂,
和对关键实验步骤的优化设计。
科研就像赛跑,你比别人跑的快,就比别人多发几篇SCI~
火辣七月月,咱们从IHC说起……
是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及相对定量的研究,
实验流程
1. 洗载玻片:将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中,目的是为了是载玻片上的硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整,便于组织吸 附,然后置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右),再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C温箱中,将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面,由于Lys带正电,而大多数的组织带负电荷,从而产生吸附作用。
2.包埋组织:先在铁模具中加入一些液态石蜡,先稍微冷却,然后再将待包埋的组织置于石蜡之中,并排列整齐,再将塑料模具盒盖上,最后加入少许液体石蜡,进行冷冻,使石蜡变成固态。
3. 切片:将包埋好的组织从模具上取下来,并置于石蜡切片机上,切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致,然后调节切片的厚度,一般为 5µm,如果比较难切,则可以适当调整厚度,用毛笔将切割的载玻片向外拉,并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40°C温水中。
4.捞组织:当组织载玻片置于40°C温水中之前,要先将水浴中的气泡赶走,以免气泡受热上浮而贴到组织上,组织受热展开,最好是组织不起皱纹,用载玻片 捞组 织时,一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张,其中2-3张是备用的,每张载玻片上通常捞两份组织,做对照使用,这样形成的误差就比 较小了,而且捞载玻片的时候最好方向一致,以便观察,再将捞出来的载玻片置于架子上,放入37°C温箱中烘干。
5.脱蜡:依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,起脱蜡作用的主要是二甲苯, 依据 的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min.
6. 抗原修复:脱蜡后在清水中冲洗一段时间,加入3%H2O2浸泡10min,从而除去内源性的过氧化氢酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗两次,再加入柠檬酸 缓冲液,放入微波炉中蒸煮3min(中火),一般刚到沸腾即可,冷却至室温,然后再蒸煮一次,冷却至室温,蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
7. 血清封闭:冷却至室温后,将柠檬酸缓冲液倒掉,水洗2次,并将载玻片置于PBS中5min,洗2次,擦干组织周围的PBS液,马上加上血清,使一些非特异 性的位点封闭起来,然后放入37°C温箱中半小时。血清稀释10倍(900µlPBS:100µl血清封闭 液)。
8. 加一抗:将温箱中的载玻片取出,用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清,加一抗,如果做对照实验,就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。
9. 加二抗:将载玻片从冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时。
10. 加SABC:将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上SABC, 然后置于37°C温箱中半小时。SABC稀释100倍(990µlPBS:10µlSABC)。
11. 加显色剂:将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上显色剂。(显色剂的配置:在1ml水中加1滴显色剂A,摇匀,然后加1滴显色剂B,摇匀, 再加1滴显色剂C,摇匀) A:DAB B:H2O2 C:磷酸缓冲液
12. 复染:将显色后的片子用清水冲洗一段时间后,浸泡于苏木精中染色,一般动物组织为半分钟,植物组织3-5min。
13. 脱水:将复染后的片子置于水中冲洗后,依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min,最后浸泡在二甲苯中,搬到通风柜中。
14. 封片:用中性树胶滴在组织旁边,再用盖玻片盖上,要先放平一侧,然后轻轻放下另一侧,以免产生气泡,封好片子后置于通风柜中晾干。
(免疫组化图)
1、固定 :Z好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片,甲醛固定有时比冰冻丙酮好;但对于不同的组织和抗原 ,可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液,请于购置前注意说明书。
2、石蜡片与冰冻片的选择:石蜡片制作多设备要求较冰冻片低,组织结构更好,保存条件简单时间也久。但对部分蛋白有较强烈的破坏作用,对蛋白保护较冰冻片差。冰冻片对蛋白的保护较石蜡片好,制作起来也比较快。
3、灭活内源性酶: HRP系统:3%双氧水灭活;AP系统:3%HAc灭活。
4、暴露抗原 : 对于石蜡切片的免疫组化实验时,必须采用高温加热抗原修复,这将有助于暴露抗原决定簇,从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的Z佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织,不同的抗原,不同的抗体,所采用的方法应不一样,可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
5、封闭:常用的封闭液有5%BSA和血清,BSA是通用型。血清应选择与二抗同源的血清。
6、显色: 一定要在显微镜下观察,注意控制背景。
7、组织脱水,透明 :时间不能太长,否则在切片时容易碎片,切不完整。
一、缺乏染色
可能的原因 | 建议 |
没有抗原 | 用原位杂交的方法检测蛋白表达(有时即使能检测到mRNA。翻译也有可能受阻) |
由于错误的储存方法 | 按照说明书储存。通常,将抗体按照足够配制单次实验工作溶液的体积分装。储存在手动除霜冰箱中(-20到-70℃),避免反复冻融 |
无效的一抗或二抗 | 单独检查报告系统以评估试剂的有效性。 |
固定不充分 | 尝试增加固定时间或改用不同的固定剂 |
不兼容的二抗和一抗 | 使用可以与一抗结合的二抗。例如,如果一抗是兔源的,则使用抗兔的二抗 |
在与一抗孵育前抗原被破坏 | 如果内源性过氧化物酶的封闭是在加入一抗前进行的,则改为加入一抗之后在封闭 |
抗原修复无效 | 增加修复时间或更换修复液 |
二、高背景
可能原先 | 建议 |
一抗或二抗的浓度过高 | 对抗体进行滴定以确定获得特异性反应的最佳浓度 |
抗体和组织中蛋白的疏水相互作用 | 降低抗体稀释液的离子强度(降低盐浓度对单克隆抗体尤其有效) |
一抗和/或二级试剂与组织的非特异性结合 | 一抗孵育前进行封闭(我们用1%的牛血清蛋白或者10%的正常驴血清,也可以使用脱脂奶粉) |
组织过于干燥 | 在染色过程中避免组织干燥 |
固定过度 | 改变抗原修复方法或减小抗原修复强度 |
显色底物过量或显色时间太长 | 缩短底物孵育时间 |
封闭不充分 | 选择合适的封闭液,延长封闭时间 |
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