DNA ladder法检测细胞凋亡

上海康朗生物科技有限公司

DNA ladder法检测细胞凋亡

发生细胞凋亡时，内源性核酸酶被激活，染色体DNA链在核小体之间被切割，形成180～200个碱基或其整数倍的DNA片段，将这些DNA片段抽提出来进行电泳，可得到DNA梯状条带（DNA ladder）。

一、材料与试剂

凋亡细胞；

蛋白酶K（500μg/ml）

8mol/L 醋酸钾

白细胞裂解液：pH8.0，10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，1% SDS。

氯仿

无水乙醇，70%乙醇；

2%琼脂糖凝胶。

二、操作步骤

1. 收集凋亡细胞：取1～2×106 个细胞，离心后，立即用70%酒精（-20℃）固定2h；

2. 洗涤：取出酒精固定的细胞，1000r/min离心5min ，去掉上清液，PBS洗二次；

3. 裂解细胞：加400μl细胞裂解液，充分混匀再加蛋白酶K100μl，置65℃水浴消化2小时或过夜；

4. 蛋白处理：加75μl 8mol/L的醋酸钾，4℃15min，再加750μl氯仿，充分混匀后，10000r/min离心10分钟后，将上清移至一新的Eppendorf管中；

5. 沉淀DNA：加入750μl无水乙醇，上下轻柔颠倒混合，即可见乳白色沉淀，若不明显时可置-20℃过夜，12000r/min离心10分钟，去上清；

6. 洗涤DNA：加1ml70%乙醇，混匀，10000r/min 离心5min，去上清；

7. 溶解DNA：根据 DAN 沉淀的大小，加一定量的蒸馏水或TE，37℃溶解；

8. 测定DNA浓度；

9. 2%琼脂糖凝胶电泳80V 2小时；

三、结果判断

出现梯状电泳条带，最小的条带为180～200 bp，其他的条带为其整倍数大小。坏死细胞则出现弥散的电泳条带，无清晰可见的条带。正常细胞DNA基因条带因分子量大，迁移距离短，故停留在加样孔附近。

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