日常科研三件套
文献、实验和文章
白天做实验,晚上看文献
相信各位老师在做实验的时候会遇到各种各样的问题
今天我们就来讲讲免疫荧光实验中
遇到的各种各样的问题,
包括它的概念和原理等等,,,
免疫荧光技术(Immunofluorescence technique )又称荧光抗体技术,是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合,利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性,所以当抗原抗体发生反应时,只要知道其中的一个因素,就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上,与其相应的抗原(或抗体)结合后,在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
直接法
将标记的特异性荧光抗体,直接加在抗原标本上,经一定的温度和时间的染色,用水洗去未参加反应的多余荧光抗体,室温下干燥后封片、镜检。如检查未知抗原,先用已知未标记的特异抗体(第一抗体)与抗原标本进行反应,用水洗去未反应的抗体,再用标记的抗抗体(第二抗体)与抗原标本反应,使之形成抗体—抗原—抗体复合物,再用水洗去未反应的标记抗体,干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体,则表明抗原标本是已知的,待检血清为第一抗体,其它步骤的抗原检查相同。标记的抗抗体是抗球蛋白抗体,同于血清球蛋白有种的特异性,如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应,因此,制备标记抗体适用于任何抗原的诊断。
其应用范围极其广泛,可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别,又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。
(1) 细胞准备。对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS洗两次;对悬浮生长细胞,取对数生长细胞,用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
(2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min.
(3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.
(4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭,时间一般为30min.
(5) 一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次,每次冲洗5min.
(6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次,每次冲洗5min后,再用蒸馏水漂洗一次。
(7) 封片及检测。滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查。
1、染完之后没有封片前直接照一 些,因为有的时候可能封片会出现问题,再想照反而没有了,另外不要拖太长时间,荧光会崔灭的。
2、荧光的片子定要避光保存, 保存的好的话,过一段时间仍然能照出很好的片子。
3、二抗用之前一定离心,不然有的时候有那种沉淀,在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点,非常难看。
4、整个操作在4°C下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高1 0倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
5、洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。
6、加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白F受体,降低和防止非特异性染色。
7、细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。抗淬灭剂可拿来直接封片,20微升即可,之后片子可保留更长时间。
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