供货周期: | 现货 |
品牌: | LMAI Bio |
规格: | 100μl |
货号: | CAT#: LM1071 |
CAS号: |
DH10Bac感受态细胞
DH10Bac Chemically Competent Cell 产品说明书
产品规格(CAT#: LM1071)
DH10Bac: 100μl/支
pUC19 (control vector,10pg/μl): 10μl
保存条件(保质期): -80℃(6个月)
DH10Bac感受态细胞基因型
F- mcrA ?(mrr-hsdRMS-mcrBC) ?80lacZ?M15 ?lacX74 recA1 endA1 araD139 ?(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsLnupG /pMON14272 / pMON7124
DH10Bac感受态细胞产品说明
DH10Bac菌株主要用于生产重组杆状病毒分子(Bac-to-Bac杆状病毒表达系统)。该菌株中含有父本杆粒 bMON14272 、辅助质粒 pMON7124 :父本杆粒 bMON14272包含 mini-F复制子, 卡那抗性基因, attTn7 位点和 lacZα互补因子;辅助质粒 pMON7124 含有 tnsABCD区(tnsABCD region supplies the transposition proteins required for insertion of the mini-Tn7 from the donor plasmid into its target site on the parent bacmid),具有四环素抗性,在细胞扩增过程中丢失,但可提高供体质粒pFastBac(具有庆大霉素抗性)转化后的基因转座效率。mcrA、mcrBC及mrr突变使DH10Bac菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA(Therefore , genomic DNA , both prokaryotic and eukaryotic, can be cloned efficiently in DH10Bac)。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。?80lacZΔM15 的存在使DH10Bac可用于蓝白斑筛选,DH10Bac感受态细胞经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率>108cfu/μg DNA。
DH10Bac感受态细胞操作方法
供体质粒(pFastBac等)转化重组方法:
1. DH10Bac感受态细胞从-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入供体质粒(pFastBac等)1ng,并用手拨打EP管底混匀,冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒,迅速放回冰中并静置2分钟,晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入900μl不含抗生素的SOC液体培养基,37℃,225 rpm复苏4小时。
4. 复苏完成后,用SOC稀释转化液到(10-1,10-2),每个稀释用吸取100ul铺一个LB平板(共涂3个平板),平板包含50ug/ml Kan,7ug/ml Gentamicin,7ug/ml tetracycline,40ug/ml X-gal,40ug/ml IPTG。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱48h(抗生素含量较高,需在37度长时间培养才能挑到合适克隆)。
阳性验证:
1. 挑10个白色的克隆,重新划线在LB平板(50ug/ml Kan,7ug/ml Gentamicin,7ug/ml tetracycline,40ug/ml X-gal,40ug/ml IPTG)。37度过夜培养。
2. 挑选白色的克隆,转接到含有50ug/ml Kan,7ug/ml Gentamicin,7ug/ml tetracycline的LB培养液中,过夜培养。
3. 使用试剂盒(QIAGEN cat. 12162)或异丙醇-醋酸钠法抽提重组质粒DNA(>100kb)。使用PCR法分析重组质粒是否正确重组。
pUC19检测转化效率方法:
1. DH10Bac感受细胞态从-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底混匀,冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒,迅速放回冰中并静置2分钟,晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养液LB,37℃,200 rpm复苏60分钟。
4. 取100μl转化液涂布到含50-100ug/ml氨苄的LB平板上。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱12-16h,统计计算转化效率。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化,插入冰中8分钟内加入目标DNA,不可在冰中放置时间过长,长时间存放会降低转化效率。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 涂板时务必涂干,平板表面不留任何水份。
同一批感受态细胞,用含目的片段的T载体质粒转化(阳性对照)能长出密密麻麻的菌落,而用另一种载体和目的片段的连接产物转化,却一个菌都没长出来,重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关,还是连接出了问题?哪个可能性大些?
答:应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照,确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。
感受态细胞放到-80冰箱了有半年了,还能用来转化质粒吗?
答:如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况,是可以用来转化的,但是由于冻存时间过长,转化效率会有所下降,如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的,如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。
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