SURE感受态细胞

SURE感受态细胞

SURE Chemically Competent Cell 产品说明书  

产品规格（CAT#: LM1065）

SURE：                                                          100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                      10μl

保存条件(保质期)：                              -80℃（6个月） 

SURE感受态细胞基因型

E. coli B e14^-(mcrA^-) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1 gyrA96 thi-1 supE44 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kan^r) uvrC [F′ proAB lacI^qZΔM15 Tn10 (Tet^R)]

SURE感受态细胞产品说明

真核生物DNA存在较多“十字型”、“Z字型”等二级或三级结构，这种DNA结构在利用传统大肠杆菌进行克隆时易被大肠杆菌体内的重组酶系统或其他防御系统识别并对其进行重组，删除等破坏，导致很难对这类DNA进行正确的克隆操作。SURE菌株可以解决这些问题：此菌株体内重组酶系统整条通路被破坏，并且 (McrA-, McrCB-, McrF-, Mrr-, HsdR-)这些限制性突变的存在赋予此菌株无法对外源DNA进行标记、限制，提高了外源甲基化DNA的克隆效率，同时具有核酸酶 (endA)突变、重组酶 (recB recJ)突变，增强了外源DNA的稳定性。存在于F′因子上的lacIqZΔM15基因使此菌株可以进行蓝白斑筛选；Kan^r，Tet^r赋予菌株卡那霉素和四环素抗性。SURE感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率达5×10⁸ cfu/μg DNA。

SURE感受态细胞常规操作方法

1. SURE感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA (质粒或连接产物) 并用手拨打EP管底轻轻混匀 (避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。

4. 5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

Stratagene standard protocol

1. Pre-chill a 14-ml BD Falcon polypropylene round-bottom tubes on ice. Preheat NZY+ broth to 42℃.

2. Thaw the cells on ice. When thawed, gently mix and aliquot 100 μl of cells into the pre-chilled tubes.

3. Add 4 μl of the β-ME (β巯基乙醇) to the aliquot of cells.

4. Swirl the tubes gently. Incubate the cells on ice for 10 minutes, swirling gently every 2 minutes.

5. Add 0.1-50 ng of the experimental DNA (or 2 μl of a ligation mixture) to the aliquot of cells.

6. Swirl the tubes gently, then incubate the tubes on ice for 30 minutes.

7. Heat-pulse the tubes in a 42℃ water bath for 30 seconds. The duration of the heat pulse is critical.

8. Incubate the tubes on ice for 2 minutes.

9. Add 0.9 ml of preheated (42℃) NZY+ broth and incubate the tubes at 37℃ for 1 hour with shaking at 225-250 rpm.

10. Plate ≤200 μl of the transformation mixture on LB agar plates containing the appropriate antibiotic (and containing IPTG and X-gal if color screening is desired).

11. Incubate the plates at 37℃ overnight. If performing blue-white color screening, incubate the plates at 37℃ for at least 17 hours to allow color development (color can be enhanced by subsequent incubation of the plates for 2 hours at 4℃).

注意事项

1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

2. 混入质粒或连接产物时应轻柔操作。

3. 转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

4. 此菌株具有卡那霉素，四环素抗性，拥有这两种抗性的质粒无法使用；对<40 μg/ml氯霉素有抗性，但对100 μg/ml氯霉素敏感。使用其他抗生素参考浓度：氨苄青霉素 (终浓度: 100 μg/ml），氯霉素 (终浓度: 100 μg/ml)。

5.SURE感受态细胞采用常规转化方法，转化效率可达5×10⁸ cfu/μg DNA。如果有更高要求，可尝试Stratagene公司推荐的标准protocol。

同一批感受态细胞，用含目的片段的T载体质粒转化（阳性对照）能长出密密麻麻的菌落，而用另一种载体和目的片段的连接产物转化，却一个菌都没长出来，重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关，还是连接出了问题？哪个可能性大些？

答：应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照，确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。

感受态细胞放到-80冰箱了有半年了，还能用来转化质粒吗？

答：如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况，是可以用来转化的，但是由于冻存时间过长，转化效率会有所下降，如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的，如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。