供货周期: | 现货 |
品牌: | LMAI Bio |
规格: | 100μl |
货号: | CAT#: LM1002 |
CAS号: |
BL21(DE3) Electro感受态细胞
BL21(DE3) Electroporation-Competent Cell 产品说明书
产品规格(CAT#: LM1002)
BL21(DE3) Electroporation-Competent Cell 50μl/支
pUC19 (control vector,10pg/μl): 10μl
保存条件(保质期): -80℃(6个月)
BL21(DE3) Electro感受态细胞基因型
F- ompT hsdSB(rB- mB- ) gal dcm(DE3)
BL21(DE3) Electro感受态细胞产品说明
BL21(DE3)为Lon蛋白酶和OmpT外膜蛋白酶缺陷菌株。λ噬菌体DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶,该区整合于BL21的染色体上,所以称为BL21(DE3)。BL21(DE3)菌株可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶,用于pET系列,pGEX,pMAL等质粒的蛋白表达。唯地生物生产的BL21(DE3)电击感受态细胞经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率达1×1010 cfu/μg DNA,可用于各种多肽,蛋白表达文库的构建。
BL21(DE3) Electro感受态细胞操作方法
1. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的BL21(DE3)电击感受态细胞插入冰中5 分钟,待其融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。
A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19;
B. 对于连接产物,大部分公司的T4连接酶反应体系或50度反应重组体系可与BL21(DE3)电击感受态混合后电击转化, 无需进行DNA纯化,但DNA浓度不能过高,DNA浓度不超过100 ng/μl,体积不超过5 μl/50 μl感受态。
C. 对盐浓度较高的DNA溶液或反应体系请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬,然后与BL21(DE3)电击感受态混合进行电击转化。
3. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中,避免产生气泡,盖上杯盖。
4. 启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数,也可按所用电转仪推荐的参 数操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。
5. 2分钟后从冰中取出电击杯,放室温,加入700 μl不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基(室温),用1ml 枪吹吸电击杯底部 数次混匀后,转移到50 ml离心管(BD Falcon 50 ml锥形离心管等),向离心管中补加S.O.C. 培养基至10 ml。37℃, 225 rpm复苏60分钟。
6. 5000 rpm离心一分钟收菌,重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上(因菌量较大,若全部涂板请选用 直径15cm培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。
S.O.C 培养基配方
2% Tryptone
0.5% Yeast Extract
10 mM NaCl
2.5 mM KCl
10 mM MgCl2
10 mM MgSO4
20 mM glucose
PH-7.0
S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain
maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).
注意事项
1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。
2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡,气泡会增加弧光放电风险。
3. 当DNA不纯或存在盐,乙醇,蛋白及缓冲液等污染时,转化效率急剧下降。
4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导,增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率,推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
6. 对于连接产物转化,部分公司的连接体系或重组体系(例如:Thermo,NEB公司的T4 连接酶系统,NEB,天根的50度反应重组系统)可以直接与BL21(DE3)电击感受态混合后电击转化,无需纯化,但DNA浓度不能过高,最好不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率,增加弧光放电的风险。
7. 混入质粒时应轻柔操作,吸取感受态细胞时避免用力过猛,以免剪切力过大损伤细胞膜,降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。
同一批感受态细胞,用含目的片段的T载体质粒转化(阳性对照)能长出密密麻麻的菌落,而用另一种载体和目的片段的连接产物转化,却一个菌都没长出来,重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关,还是连接出了问题?哪个可能性大些?
答:应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照,确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。
感受态细胞放到-80冰箱了有半年了,还能用来转化质粒吗?
答:如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况,是可以用来转化的,但是由于冻存时间过长,转化效率会有所下降,如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的,如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。
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