供货周期: | 现货 |
品牌: | LMAI Bio |
型号: | 100μl |
货号: | CAT#: LM1050 |
Ar.A4感受态细胞
Ar.A4 Chemically Competent Cell 产品说明书
产品规格 (CAT#: AC1050)
Ar.A4: 100μl/支
pK7WGF2(control vector,10ng/μl ) 10μl
保存条件(保质期): -80℃(12个月)
Ar.A4感受态细胞基因型
Agrobacterium rhizogenes(kanR ) Ar A4 Ri(agropine type)
Ar.A4感受态细胞产品说明
发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌,它能够感 染 大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。Ar.A4发根农杆菌菌株含有农杆碱型Ri质粒, 具有广泛的宿主范围(玉米,烟草,胡萝卜,甘草等),同时具有卡那霉素抗性。本公司生产的Ar.A4化 学转化感受态细胞经特殊工艺制作,pK7WGF2质粒(壮观霉素抗性)检测,转化效率>104 cfu/μg DNA。
Ar.A4感受态细胞常规操作方法
1.取-80℃保存的Ar A4发根农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化,处于冰水混合状态时插入冰中。
2.每100μl感受态加入0.01-1 μg质粒DNA(转化效率较高,第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量)
,用手快速、剧烈拨打管底混匀或用枪吹吸混匀,依次放于冰中静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、
冰浴5分钟。
3. 冰浴中拿出放室温,加入700μl 无抗生素的TY 液体培养基,于 28℃振荡培养 2小时。
4. 6000 rpm 离心一分钟收菌,留取 100 μl 左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的 TY平板上,
倒置放于 28℃培养箱培养 2-3 天
● 农杆菌相关抗生素配方: 抗生素 配方 原液 工作液 羧苄青霉素 (carb) 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 50 mg/ml 50 μg/ml 硫酸卡那霉素 (kan) 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 50 mg/ml 50 μg/ml 链霉素 (strep) 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 10 mg/ml 50 μg/ml 利福平 (rif) DMSO溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 10 mg/ml 20 μg/ml 庆大霉素 (gent) 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 20 mg/ml 40 μg/ml 氯霉素(cam) 无水乙醇溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 34 mg/ml 34 ug/ml
常用农杆菌抗性: (R:抗;S:敏感。)
农杆菌菌株 | 羧苄青霉素(carb) | 链霉素(strep) | 利福平(rif) | 氯霉素(gent) | 硫酸卡那霉素(kan) |
Ar.A4 | S | S | S | S | R |
MSU440 | S | R | S | S | S |
Ar.Qual | S | R | S | R | S |
C58C1 | S | R | R | S | S |
ATCC15834 | S | S | S | S | S |
K599 | S | R | S | S | S |
Ar.1193 | R | R | R | S | S |
● TY配方(1L):
Tryptone 5g
Yeast extract 3g
补水到1L体积,完全溶解后,121度、20分钟高温灭菌
配制1M的氯化钙水溶液,121度、20分钟高温灭菌
每1L 灭菌的TY液体营养液中加入10ml 无菌的1M氯化钙水溶液即可。
若配制TY固体培养基,则加入15g 琼脂粉。
注意事项 1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转 化效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。 2. 混匀质粒时应用手指快速拨打管底或用枪吹吸混匀,务必使质粒快速、均匀分散开, 与感受态细胞充分接触。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。 3. 平板上阳性克隆密度过大时,由于营养不足,阳性克隆生长变慢,菌落变小,为了获 得大的菌落,应减少质粒用量或降低涂板的菌量。 4. Ar.A4具有卡那霉素抗性,不可用于具有卡那霉素抗性质粒的转化。
同一批感受态细胞,用含目的片段的T载体质粒转化(阳性对照)能长出密密麻麻的菌落,而用另一种载体和目的片段的连接产物转化,却一个菌都没长出来,重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关,还是连接出了问题?哪个可能性大些?
答:应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照,确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。
感受态细胞放到-80冰箱了有半年了,还能用来转化质粒吗?
答:如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况,是可以用来转化的,但是由于冻存时间过长,转化效率会有所下降,如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的,如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。
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