肠出血性大肠杆菌O104:H4血清型探针法荧光定量PCR试剂盒

肠出血性大肠杆菌O104:H4血清型探针法荧光定量PCR试剂盒PCR在分子克隆和DNA分析中有多种用途，下面就向大家介绍PCR实验方法步骤：

方法

1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl  

视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2：调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，在72℃ 保温7min。

3：肠出血性大肠杆菌O104:H4血清型探针法荧光定量PCR试剂盒结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4：PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。

PCR实验步骤

典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：

将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；

　　人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；

　　耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。

实验过程：

一、肠出血性大肠杆菌O104:H4血清型探针法荧光定量PCR试剂盒试剂准备

1. DNA模板

2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步骤 

1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。

3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。

三、肠出血性大肠杆菌O104:H4血清型探针法荧光定量PCR试剂盒注意事项

１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。

２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。

３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。

４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。

５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。

６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。

７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。

相关PCR产品列表：

13-42300 Classical Swine Fever Virus(CSFV)猪瘟病毒RT-PCR试剂盒 50次

13-42320 Classical Swine Fever Virus-Vaccine(CSFV-Vaccine)猪瘟病毒疫苗株RT-PCR试剂盒 50次

13-42310 Classical Swine Fever Virus-WT(CSFV-WT)猪瘟病毒野生株RT-PCR试剂盒 50次

13-34510 Clostridium botulinum肉毒梭状芽孢杆菌PCR试剂盒 50次

13-34520 Clostridium chauvoei气肿疽梭状芽孢杆菌PCR试剂盒 50次

13-34530 Clostridium difficile艰难梭状芽孢杆菌PCR试剂盒 50次

13-34540 Clostridium equi马梭菌PCR试剂盒 50次

13-34550 Clostridium estertheticum 梭状芽孢杆菌PCR试剂盒 50次

13-34560 Clostridium haemolyticum溶血梭状芽孢杆菌PCR试剂盒 50次

13-34570 Clostridium histolyticum溶组织梭状芽孢杆菌PCR试剂盒 50次

13-34580 Clostridium novyi诺氏梭状芽孢杆菌PCR试剂盒 50次

13-34591 Clostridium perfringens types A产气荚膜梭状芽孢杆菌A型PCR试剂盒 50次

13-34592 Clostridium perfringens types B产气荚膜梭状芽孢杆菌B型PCR试剂盒 50次

13-34590 Clostridium perfringens产气荚膜梭状芽孢杆菌通用PCR试剂盒 50次

13-34600 Clostridium sordellii索氏梭状芽孢杆菌PCR试剂盒 50次

13-34500 Clostridium spp.梭状芽孢杆菌属通用PCR试剂盒 50次

13-34610 Clostridium tetani破伤风梭状芽孢杆菌PCR试剂盒 50次

13-56200 Coccidioides immitis粗球孢子菌PCR试剂盒 50次

13-90800 Cochliomyia hominivorax嗜人锥蝇PCR试剂盒 50次

13-46300 Colti 病毒RT-PCR试剂盒 50次

13-69400 Columbid Herpes Virus 1 鸽包含体病病毒1PCR试剂盒 50次

13-63000 Contagious Pustular Dermatitis Virus(CPDV )传染性脓疱皮炎病毒PCR试剂盒 50次

13-15810 Corynebacterium bovis牛棒杆菌PCR试剂盒 50次

13-15820 Corynebacterium diphtheriae白喉棒杆菌PCR试剂盒 50次

13-15830 Corynebacterium minutissimum极小棒杆菌PCR试剂盒 50次

13-15840 Corynebacterium pseudotuberculosis假结核棒杆菌PCR试剂盒 50次

13-15850 Corynebacterium pseudotuberculosis山羊伪结核棒杆菌PCR试剂盒 50次

13-15860 Corynebacterium pseudotuberculosis伪结核棒杆菌PCR试剂盒 50次

13-15800 Corynebacterium spp.棒杆菌通用PCR试剂盒 50次

13-15870 Corynebacterium ulcerans溃疡棒杆菌PCR试剂盒 50次

13-29500 Covert Mortality Nodavirus(CMNV)偷死野田村病毒RT-PCR试剂盒 50次