供货周期: | 现货 |
品牌: | LMAI Bio |
规格: | 50次 |
货号: | LM18-74180 |
CAS号: |
1 肺炎支原体探针法荧光定量PCR试剂盒样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA质量检测
1)紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。
① 肺炎支原体探针法荧光定量PCR试剂盒浓度测定
A260下读值为1表示40 ?g RNA/ml。样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 ?g/ml。具体计算如下:
RNA溶于40 ?l DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495?l的TE中,测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g
取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 ?l,剩余RNA总量为:
35 ?l × 0.84 ?gl = 29.4 ?g
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。
2)变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS电泳缓冲液
浓度 成分
0.4M MOPS,pH 7.0
0.1M 乙酸钠
0.01M EDTA
灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 ?l溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
肺炎支原体探针法荧光定量PCR试剂盒
②准备RNA样品
取3?gRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10?g/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
3 样品cDNA合成
①肺炎支原体探针法荧光定量PCR试剂盒反应体系
序号 反应物 剂量
1 逆转录buffer 2μl
2 上游引物 0.2μl
3 下游引物 0.2μl
4 dNTP 0.1μl
5 逆转录酶MMLV 0.5μl
6 DEPC水 5μl
7 RNA模版 2μl
8 总体积 10μl
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5μl,37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80℃等待。
13-15860 Corynebacterium pseudotuberculosis伪结核棒杆菌PCR试剂盒 50次
13-15800 Corynebacterium spp.棒杆菌通用PCR试剂盒 50次
13-15870 Corynebacterium ulcerans溃疡棒杆菌PCR试剂盒 50次
13-29500 Covert Mortality Nodavirus(CMNV)偷死野田村病毒RT-PCR试剂盒 50次
13-66800 Cowdria ruminantium反刍兽考德里氏体PCR试剂盒 50次
13-83900 Cowpox Virus(CPV)牛痘病毒PCR试剂盒 50次
13-53300 Coxiella burnetii 伯氏立克次氏体(柯克斯体)PCR试剂盒 50次
13-17216 Coxsackie Virus(CA16v)柯萨奇病毒A16型变种RT-PCR试剂盒 50次
13-17224 Coxsackie Virus(CA24v)柯萨奇病毒A24型变种RT-PCR试剂盒 50次
13-17200 Coxsakie Virus(CV)柯萨奇病毒RT-PCR试剂盒 50次
13-17100 Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus(CCHFV )克里米亚-刚果出血热病毒RT-PCR试剂盒 50次
13-56100 Cryptocaryon irritans刺激隐核虫PCR试剂盒 50次
13-45600 Cryptococcus neoformans新生隐球菌PCR试剂盒 50次
13-26810 Cryptosporidium baileyi贝氏隐孢子虫PCR试剂盒 50次
13-26820 Cryptosporidium parvum小隐孢子虫PCR试剂盒 50次
13-26800 Cryptosporidium spp.隐孢子虫通用PCR试剂盒 50次
13-26830 Cryptosporidium tyzzeri泰泽隐孢子虫PCR试剂盒 50次
13-17500 Cupixi virus(CPXV)库皮科斯病毒RT-PCR试剂盒 50次
13-71400 Cyclospora cayetanensis 环孢子虫PCR试剂盒 50次
13-36120 Cyprinid Herpesvirus (CyHV-II)鲤疱疹病2型PCR试剂盒 50次
13-36130 Cyprinid Herpesvirus (CyHV-III )鲤疱疹病毒3型PCR试剂盒 50次
13-36100 Cyprinid Herpesvirus(CyHV)鲤疱疹病毒通用PCR试剂盒 50次
13-57000 Cysticercus cellulosae猪囊尾蚴PCR试剂盒 50次
13-22800 Cytomegalovirus(CMV)巨细胞病毒PCR试剂盒 50次
13-40100 Cytoplasmic polyhedrosis virus(CPV)质型多角体病毒PCR试剂盒 50次
13-36700 Dactylogyrus spp.指环虫属通用PCR试剂盒 50次
13-53700 Dekkera bruxellensis布鲁塞尔德克酵母PCR试剂盒 50次
13-64810 Dengue Virus(DENV)登革病毒1型RT-PCR试剂盒 50次
13-64820 Dengue Virus(DENV)登革病毒2型RT-PCR试剂盒 50次
13-64830 Dengue Virus(DENV)登革病毒3型RT-PCR试剂盒 50次
13-64840 Dengue Virus(DENV)登革病毒4型RT-PCR试剂盒 50次
相关产品
关注
拨打电话
留言咨询