供货周期: | 现货 |
品牌: | LMAI Bio |
规格: | 50次 |
货号: | LM-F101 |
CAS号: |
柱式动物线粒体DNAout,PCR级
产品及特点 线粒体 DNA(mtDNA)是进行分子进化研究和母性遗传研究的重要材料,但传统的两步式 mtDNA 提取方法是先温和裂解细胞,分离线粒体,然后再从线粒体中提取 mtDNA。此方法中的温和裂解细胞的条件十分难以控制,需要针对不同组织材料单独进行优化。本方法克服了上述缺点,具有下列优点:
1. 不需要单独纯化线粒体,柱式法纯化,操作简单快捷。
2. 得到的 mtDNA 可以直接用于 PCR。
3. 每 107个动物细胞一般能得到 100ng 左右的 mtDNA,每克组织一般能得到 3-5 ug mtDNA。
4. 注意:本产品只适合于动物材料,不适合于植物材料,因为植物线粒体 DNA一般都十分巨大,非常难提。
规格及成分 成 份 编 号 大扁盒包装
柱式动物线粒体 DNA 提取溶液 A 80803A 13 mL 柱式动物线粒体 DNA 提取溶液 B 80803B 13 mL 柱式动物线粒体 DNA 提取溶液 C 80803C 18 mL 离心吸附柱 60911 50 套 通用洗柱液 60408 50 mL DNA 洗脱液 70705 10 mL 使用手册 80803sc 1 份
运输及保存 常温运输,短期可以在室温放置;长期保存最好放 4℃。
自备试剂 无
使用方法
一:培养细胞预处理
1. 用自备的 0.25%胰酶消化液处理约 107个培养细胞,离心收集后弃上清。
2. 用 PBS 或 TBS 等缓冲液洗涤细胞两次,离心得到的细胞沉淀直接用于mtDNA 提取。
二:组织细胞预处理
3. 用剪刀将 1g 新鲜的动物组织剪碎(芝麻大小最好),转移到 1.5mL 塑料离心管中,用于 mtDNA 提取。注意:最好不要使用冻存的动物组织,因为冻凝过程中形成的冰晶会将线粒体刺破,使其 DNA 释放出来被胞浆中的 DNA 酶降解,影响回收率。
三:血液预处理
4. 将 3-5 mL 抗凝外周血静置 30 分钟或低速离心 5 分钟,取白细胞层。
5. 用自备 PBS 洗涤白细胞两次,得到的白细胞沉淀用于 mtDNA 提取。四:mtDNA 提取
5. 在细胞沉淀或剪碎的组织中加入 250 uL 冰浴的溶液 A,充分吹打分散。如果是剪碎的组织,不要等成块的组织溶解即可继续下步操作。
6. 加入 250 uL 常温的溶液 B(如果溶液 B 有沉淀,用前须 37℃加热溶解后冷却到室温方可使用),温和反复颠倒混匀 10 次。千万不要剧烈振荡。
7. 冰上放置 6-8 分钟。注意不要超过 8 分钟。
8. 加入 350 uL 冰浴的溶液 C,温和混匀 4-6 次,可见白色沉淀物产生,然后放冰上放置 20-25 分钟。
9. 室温 12000-15000 g 离心 10 分钟,小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液比重较大,有时候出现沉淀漂浮是正常现象,取上清时避开漂浮的沉淀即可。
10. 静置 5 分钟以让 DNA 与离心吸附柱充分结合,此步十分重要。
11. 室温 12000-15000 g 离心 1 分钟,弃收集管中的废液。
12. 加入 500 uL 的通用洗柱液,室温 12000-15000 g 离心 1 分钟,弃收集管中废液。注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要将盖拧紧存放,否则乙醇会挥发。
13. 重复上步 1 次。
14. 室温 12000-15000 g 离心 1 分钟,甩干残留液体。此步不能省略,否则残留乙醇会影响 DNA 的后续使用(如 DNA 上样时不能沉淀到加样孔中)。
15. 将离心吸附柱置于一个新的 1.5 mL 塑料离心管中,加入 30-50 uL65-80℃预热的 DNA 洗脱液,室温放置 2 分钟。常温的 DNA 洗脱液也可以用于洗脱,但产量稍微有所降低。
16. 室温 12000-15000 g 离心 1 分钟,离心管底溶液即 mtDNA。
17. 由于本公司离心吸附柱结合 DNA 能力较强,如果再加 30-50 uL DNA 洗脱液到离心吸附柱中,往往还能洗脱下很多 mtDNA(相当于第一次洗脱的 20-30%),但注意不要使用上步得到的 mtDNA 溶液来洗脱。
18. 12000-15000 g 离心 1 分钟,离心管底溶液即线粒体 DNA。每 107个动物细胞一般能得到 100ng 左右的 mtDNA,每克组织一般能得到 3-5 ugmtDNA。如果 DNA 需要浓缩,可以使用本公司的核酸浓缩剂。
19. 由于 DNA 机械断裂,电泳时 DNA 可能不呈现专一的带,但此 mtDNA 溶液可以直接用于 PCR。
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