供货周期: | 现货 |
品牌: | LMAI Bio |
规格: | 30次 |
货号: | LM-F145 |
CAS号: |
一站式miRNA尿素-PAGE电泳套装
产品及特点尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Urea PAGE)是目前分离 200 nt 以下的小片段 RNA,尤其是 20 nt 左右的 microRNA(miRNA)分子的主要方法,但是单独配 制各种溶液十分繁琐,为此天泽基因开发了本产品。它具有下列特点:
1. 一站式,含有电泳所需要的所有试剂,即开即用,十分方便,免去了实 验人员称取有毒物品。
2. 灵活,可以根据需要配制各种浓度的 Urea-PAGE,以便对长度各异的 RNA 进行电泳。
3. 电泳后可直接用于 UV 观察、银染、胶回收、Northern 杂交等实验。
4. 使用新型缓冲液,可以防止甘油的干扰。
规格及成分 成份 编号 大纸盒包装
运输及保存 尿素 100873 210 g RT 丙烯酰胺 100864 60g,用 250mL 瓶 RT 甲叉双丙烯酰胺 100877 3g RT TBE 电泳液, 10× 90313 250 mL RT TEMED 110-18-9 1.5 mL RT 过硫酸铵 100879 1 g RT miRNAON 70608 1.5 mL 低温/-20℃ miRNA Marker 70605 150 uL 低温/-20℃ 固相 RNase 清除剂 3090 250 mL RT 使用手册 70606sc 1 份 RT
运输及保存 常温运输和保存,miRNAon、miRNA Marker 需要低温运输,-20℃保存, 保存期一年。
自备试剂 miRNA 样品、RNase-free 水。
使用方法
1. 准备工作:用固相 RNase 清除剂清洁工作平台 直接将固相 RNase 清除剂原液或 10 倍的新鲜稀释液喷于台面,5 分钟后 用普通吸水纸擦净,后用沾有固相 RNase 清除剂 1000 倍新鲜稀释液的 吸水纸擦净,晾干。
2. 准备工作:用固相 RNase 清除剂清洁玻璃和塑料器皿 将器皿浸泡在固相 RNase 清除剂的 10 或 100 倍的新鲜稀释液中,静置 处理 5 分钟后取出,再用固相 RNase 清除剂 1000 倍或 10000 倍新鲜稀 释液浸泡二次以上,倒立晾干后备用。
3. 配制 1×TBE 电泳液: 将适量的 10×TEB 电泳液用 RNase-free 水稀释 10 倍,得到 1×TBE 电泳液待用。此溶液需要现用现配,否则易长菌。
4. 配制 10%过硫酸铵溶液: 精确称取100 mg 过硫酸铵到一干净的 1.5 mL 离心管中,按每 1 mg 过硫酸铵加 10 μL RNase-free水的比例加入 RNase-free 水,摇晃溶解待用。10%过硫酸铵溶液有效期不超过一周。
5. 估计所需要的凝胶溶液的体积,一般配制一块 13 cm×15 cm× 0.8 mm 的胶需要 15 mL 凝胶溶液,配制一块 36 cm×45 cm×0.8 mm 的胶需 要 120 mL 凝胶溶液。
6. 配制 40%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液:将 3g 甲叉双丙烯酰胺加入到 装有 60g 丙烯酰胺干粉的瓶中,再加入 130 mL RNase-free 水,充分摇 晃混匀即得 40%的 Acrylamide/Bis 溶液。
7. 根据所需要的凝胶溶液的体积,在一的干净的三角瓶中按下表加入各成分
8. 搅拌并加热到 40-50℃左右,直到尿素完全溶解。
9. 冷却到室温后,将三角瓶接上真空系统抽真空处理 10-15 分钟以充分去除 溶液中的氧气(氧气会降低聚合反应效率)。若条件有限,此步可省略。
10. 边摇晃溶液变加入 50 μL TEMED 和 500 μL 10%过硫酸铵。注意:如果 选择其他工作浓度的 Acrylamide/Bis,此二成分的用量不需要随之改 变。但如果配置的凝胶溶液的体积变化,此二成分的用量要按比例改变。
11. 再充分摇晃约 30 秒后迅速灌胶,然后插入样品梳,室温放置 30-60 分钟 等待胶凝固。
12. 将凝胶板放置在电泳装置上后,在上下层分别加入适当量的 1×电泳缓冲 液。如果不马上使用,需要有湿纸将上样孔端盖住以防凝胶过度干燥。
13. 拔出梳子后用加样枪吸取电泳缓冲液,充分将每个加样空中未聚合的 Acrylamide/Bis、尿素和气泡吹打出来。
14. 在上样前,预电泳 20-30 分钟以使多余的过硫酸铵跑出加样空,同时还可 以使凝胶的温度升高(到 50℃左右),有利于 RNA 变性状态。
15. 将 miRNA 样品与等体积的 miRNAon 混合,70℃保温 2-3 分钟后迅速放 置在冰上冷却,快速离心半分钟,放冰上待用。miRNA Marker 需要每个 上样孔用 5μL,一块胶好在两侧各用一个孔上样 miRNA Marker。
16. 关电泳仪后开始上样。
17. 重开电泳仪,对 13 cm×15 cm 的胶,以 20-30mA 的电流电泳,直到红 色染料移动到凝胶边缘为止;对36 cm×45 cm 的胶,则以 50-60mA 的 电流电泳,直到红色染料移动到凝胶边缘为止。
18. 染色观察:将凝胶一面的玻璃板揭开,直接用仍然附着在另一玻璃板上的 凝胶进行各种染色,包括银染(固定、漂洗、显影和定影等步骤)、EB(每 100 mL 1×TBE 中加 20 μL 10mg/mL 的 EB 溶液)、天泽基因低毒核 酸染料 DNAgreen(每 100 mL 1×TBE 中加 10 μL DNAgreen 原 液)。 UV 下观察并拍照。
19. miRNA 回收:按上法用 EB 等染料染色后,UV 下确定所需要的 miRNA 条带的位置,切胶后进行胶回收处理。
20. Northern 杂交:按上法用 EB 等染料染色后,UV 下确定所需要的 miRNA 条带的位置,切胶后电转移到带正电的尼龙膜上,然后进行杂交处理。
21. 放射自显影:如果 miRNA 样品电泳前经过同位素标记,则将凝胶一面的 玻璃板揭开,用滤纸将附着在另一玻璃板上的凝胶吸附过来,然后包上保 鲜膜,真空抽干,然后使胶跟 X 光片向对置进行放射自显影。
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