供货周期: | 现货 |
品牌: | LMAI Bio |
规格: | 5次 |
货号: | LM-F207 |
CAS号: |
PCR法DNA探针生物素标记试剂盒
产品及特点PCR 标记的原理是用带标记的 dNTP 进行 PCR,最后得到的 PCR 产物 将带有标记,可以直接用于杂交试验。本产品就是基于上述原理的基础上开 发,它具有下列特点:
1. 一站式,本试剂盒提供经过优化的试剂,不需要用户自己摸索。
2. 足够 10 次 50 uL 体系的常规 PCR(用于制备标记反应的模板和设置对 照反应)和 5 次 50 uL 体系的标记反应。
3. 一次标记可以得到ug级的双链DNA探针或约700ng 的单链DNA探针, 足够多次杂交实验用。
4. 既可用于制备双链探针,也可以用于单链探针。
5. A 型需自备含标记核苷酸的 dNTP, B 和 C 型分别含生物素和地高辛标 记的底物。可用的自备标记底物包括 fluorescein-dUTP、 hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP 和 aminoallyl-dUTP 等。
6. 掺入率一般为 4-5%,有效降低了空间阻碍,检测效果最佳。
7. 标记探针可以用于 Southern 和 Northern Blot、原位杂交、菌落和斑 点印迹杂交等分析。
8. 本产品足够 5 次非标记 PCR 和 5 次标记 PCR(均指 50uL 体系)。
规格及成分 A 型成 份 编 号 十孔盒包装
2×标记专用 PCR Mix LM90604a 500uL(黄盖)
dATP,10 mM each LM130912 50uL(白盖)
dTTP,10 mM each LM130913 50uL(绿盖)
dGTP,10 mM each LM130914 50uL(红盖)
dCTP,10 mM each LM130915 50uL(本色盖)
超纯水 LM100935 1 mL(蓝盖)
使用手册 LM90604sc 1 份
B 型(生物素)
成 份 编 号 十孔盒包装
2×标记专用 PCR Mix LM90604a 500 uL(黄盖)
含 Biotin-11-dUTP 的 dNTP,2mM 90604b 25 uL(绿色)
dNTP Mix,2 mM each 51208 50 uL(白盖)
超纯水 100935 1 mL(蓝盖)
使用手册 90604sc 1 份
C 型(DIG)
成 份 编 号 十孔盒包装
2×标记专用 PCR Mix 90604a 500 uL(黄盖)
含DIG-11-dUTP的dNTP,2mM 90604c 25 uL(绿色)
dNTP Mix,2 mM each 51208 50 uL(白盖)
超纯水 100935 1 mL(蓝盖)
使用手册 90604sc 1 份
运输及保存 低温运输,-20℃保存,有效期一年。
自备试剂 DNA 模板和模板专一性引物。
使用方法一:准备工作
1. 按常规的方法设计 PCR 引物,使探针长度在 400-800bp 之间。过短则 标记参入少,探针杂交信号强度减弱;过长则非特异杂交增加,背景变强。
2. 由于标记的 dNTP 比较珍贵,所以不推荐以基因组 DNA 或其他复杂 DNA 为模板直接进行 PCR 标记,而是建议采取下述的两步法标记来提高成功 率,即先制备非标记 PCR 产物,再以之为模板制备标记的 PCR 产物。
3. 对 A 型标记试剂盒,四种 10mM 的 dNTP 是分开提供,用于制备 50uL 非标记 dNTP(2mM each,用于非标记 PCR,用于制备标记 PCR 的模 板。配制方法是四种 10mM 的 dNTP 各加 10uL,再加水 10uL 即可) 和 25uL 标记 dNTP(2mM each,其中标记核苷酸和对应的非标记核苷 酸的比例需要自行优化,假如是 biotin 或 DIG 标记的是 dUTP,则其对 应的非标记核苷酸是 dTTP,两者的最佳比例一般为 1:3;如果是 BrdUTP,则两者的最佳比例为 1:1。配制方法是三种 10mM 的 dNTP 各加 5uL,再加标记核苷酸和其对应的标记核苷酸使其总的终浓度为 2mM,再补水到 25uL)。
二:非标记 PCR 产物的制备
4. 设置50uL非标记PCR:2×标记专用PCR Mix 25 uL,dNTP Mix(2mM each)5uL,自备的探针引物(10pmol/uL)各 1uL,1 ug 基因组 DNA 或 1ng 质粒 DNA,补超纯水到 50 uL。
5. 按已经优化的 PCR 参数进行常规 PCR。
6. 胶回 PCR 产物并定量,胶回收可以避免残留引物干扰后续的标记 PCR。
三:标记 PCR 反应(最好做一个不加标记的对照用于定量)
注意:由于双链 PCR 探针在杂交时变性的双链彼此还会复性,降低杂交 效率,因此强烈推荐使用单链标记 PCR。
效率,因此强烈推荐使用单链标记 PCR。 成份 样品 非标记对照 2×标记专用 PCR Mix 25 uL 25 uL A 型:含标记核苷酸的 dNTP Mix B 型:含 Biotin-11-dUTP 的 dNTP C 型:含 DIG-11-dUTP 的 dNTP 5 uL 不加 dNTP Mix,2mM 不加 5 uL 若单链标记:加探针引物其一 50 pmol 50 pmol 若双链标记:加探针引物一和引物二 各 50 pmol 各 50 pmol 胶纯化所得 PCR 产物(单链标记可 用 100ng 模板) 10 ng 10 ng 超纯水 补到 50 uL 补到 50 uL
注意:本试剂盒提供的 dNTP 混合物总浓度为 2mM,所含标记 dUTP 与 非标记 dTTP 的比例已经进过优化。
7. 按第 5 步的 PCR 参数进行标记 PCR,但需要进行下列修改:一是循环数 增加到 35-55 个循环。由于模板为纯化后的 PCR 产物,探针对扩增长度 完整性要求不高(长度不均的探针由于能形成网络结构,效果反而更好), 所以可以增加循环数;二是延伸时间增加 15 秒,因为标记 dUTP 参入到 DNA 的速度比常规的 dTTP 慢;三是降低复性温度 5-7℃,因为标记核 苷酸参入到 DNA 后,新模板的 Tm 值将降低。
8. 标记探针的定量:取标记反应液和对照反应液 1-5 uL,在琼脂糖凝胶上 跟浓度已知的 DNA marker 一起电泳,并判断探针的浓度。由于标记产 物中额外带有生物素,地高辛等、其泳动速度将慢于非标记 PCR 产物(但 同位素标记不能用此法)。下图是一个典型的双链 PCR 产物电泳结果图: 标记的 DNA(右)与未标记的 DNA(左)电泳比较
注意:如果扩增的是单链 DNA 探针,其结合 EB 的能力远低于双链 DNA, 因此 EB 染色的强弱不能准确反应 DNA 的真实浓度,可以采用银染定量(跟 marker 比较)。一般 100ng 模板经单链 PCR 扩增可得到 700ng 左右探针。
9. 剩余的 PCR 标记产物可以不经过纯化,直接加入(对单链 PCR 探针) 杂或加热变性并急冷后加入(对双链 PCR 探针)到杂交液中使用。也可 放-20℃长期保存。如果需要纯化,请使用乙酸铵/乙醇沉淀法纯化。
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