供货周期: | 现货 |
品牌: | LMAI Bio |
规格: | 100次 |
货号: | LM-F272 |
CAS号: |
可调式易错PCR试剂盒
产品及特点易错 PCR(error-prone PCR)是利用 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′校对功能的特性,在一定条件下(如不同的 dNTP 浓度、Mg 浓度和 MnCl2存在)能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法,则可从构建的突变库选出所需突变体。易错 PCR 和常规 PCR的比较如下:
本产品是在本公司的易错 PCR 试剂盒基础上改进而得,本产品具有下列特点:
1. 即开即用,十分简单方便,尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2. 配方经过精心优化,实验人员在一定范围内可以控制突变率,一轮 PCR 的突变率范围在 2-8突变/1000bp,更高的突变率可以通过多轮 PCR 达到。
3. 可用于连续易错 PCR(sequential error-prone PCR),只需把上一次易错 PCR 的产物用作下一次易错 PCR 的模板即可,使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
4. 可以扩增的 DNA 片段更长,达到 2kb,对于 2kb 以上的产物,建议分段扩增。
5. 本试剂盒足够 100 次 30uL 体系的易错 PCR。
运输及保存 低温运输,-20℃保存, 有效期为一年。
自备试剂 引物、DNA 模板、常规 PCR 试剂盒。
使用方法
1. 将引物稀释到 10uM。引物也是决定易错 PCR 成败的关键因素,设计引物时要保证其 Tm在 70℃,长度在 25-30nt 之间,GC 含量在 45%-60%之间,3 端 GC 含量低,并且没有发夹结构。
2. 用自备易错 PCR 引物和常规 PCR 试剂扩增制备易错 DNA 模板(常规 PCR 产物),胶回收并准确确定浓度。注意:易错 PCR 的模板一定要用胶回收的常规 PCR 产物,因为胶回收会可以把电泳不可见的非特异性扩增片段去除,否则这些片段由于也是用易错 PCR 引物扩增所得,在易错 PCR 扩增时也会扩增,产生竞争抑制,降低靶分子的扩增效率。如果常规 PCR 制备模板的引物和易错 PCR 引物不同(类似巢式 PCR)则可以避免此问题,但需要合成两对引物。
3. 将回收的 DNA 片段(模板)稀释到 1ng/uL 、10ng/uL 和 100ng/uL 三个浓度。注意:模板使用量是影响突变率的最重要因素,模板 DNA 为非突变 DNA,扩增产生的 DNA 为突变 DNA,易错 PCR 体系最终 DNA 量是基本固定的,因此模板 DNA 使用量越大,则突变 DNA 在终产物中的相对比例就越低,突变率就越低。反之亦然。但模板太少又不容易扩增成功,所以建议同时测试两个模板用量。如果都成功,则优先选用模板浓度低的 PCR 产物进行分析。
4. 根据每 1000bp 的预期突变数按下表确定 30uL 易错 PCR 体系中 MnCl2和 dGTP 的用量(这是在模板DNA不超过1ng的前提下的数据)。表中的Mn表示易错PCR专用的MnCl2,dG 表示易错 PCR 专用的 dGTP:
预期突变数 2 个 3 个 4 个 5 个 6 个 7 个 8 个
Mn 用量(uL) 0 1.0 2.5 4.0 4.0 4.0 4.0
dG 用量(uL) 0 0 0 1.0 2.0 3.0 4.0
5. 一次建议设置 3 个模板浓度。在 3 干净的 PCR 管中,分别加入下列成分(这里是设置30uL 的反应体系,如果反应体系不是 30 uL,则各成分用量需要按等比例增加或减少):
成分 模板用量 1 模板用量 2 模板用量 3
易错 PCR Mix, 10× 3 uL 3 uL 3 uL
易错 PCR 专用 dNTP,
10×
3 uL 3 uL 3 uL
易错 PCR 专用 MnCl2 根据上步计算 根据上步计算 根据上步计算
易错 PCR 专用 dGTP 根据上步计算 根据上步计算 根据上步计算
自备 DNA 模板 1 uL 1 uL 1 uL
(1ng/uL) (10ng/uL) (100ng/uL)
自备 PCR 引物
(10 uM each) 1 uL each 1 uL each 1 uL each
易错 PCR 专用
Taq DNA 聚合酶 0.5 uL 0.5 uL 0.5 uL
超纯水 补水到 30uL 补水到 30uL 补水到 30uL
6. 按已经优化的常规 PCR 条件进行易错 PCR:
PCR 前变性 94℃ 3 分钟
易错 PCR(循环 30-60 次)
94℃ 1 分钟
45℃ 1 分钟
72℃ 1 分钟(对 1Kb 长的模板)
注:易错 PCR 一般不需要热启动,也不需要在 PCR 结束后做延伸处理。长度每增加 1Kb,时间延长 1分钟。易错 PCR 循环次数越多,突变 DNA(扩增产物)与非突变 DNA(模板)的比例就越高。此外在突变率和模板长度恒定的情况下,扩增次数越多,发生突变的数就越高,在同一模板上发生的突变位点数就越多,所以一次实验时好做 30、35、40、45、50、55、60 次 7 个循环数的比较。
7. 电泳检测是否得到预计长度的 PCR 产物。如果没有,可以调整模板用量和 PCR 参数。
8. 胶回收易错 PCR 扩增产物、克隆并对单菌落进行功能筛选或测序分析、如果需要增加突变率,可以以突变后的 DNA 为模板,进行下一轮易错 PCR。
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