供货周期: | 现货 |
品牌: | LMAI Bio |
规格: | 50次 |
货号: | LM-F289 |
CAS号: |
两步法荧光定量RT-PCR试剂盒
产品及特点本试剂盒是整合 cDNA 一链合成试剂(RT 试剂盒)和即用型 qPCR 试剂而得的 qRT-PCR 试剂盒。cDNA 一链合成反应和 qPCR 反应分别在两个离心管中进行。本试 剂盒具有下列特点:
1. 即开即用,足够 50 次 RT 反应(10uL 体系)和 50 次 qPCR 反应(20 uL 体系)。
2. RT 和 PCR 分开进行,方便优化 RT 和 qPCR 条件,也方便一个 RT 反应用于多个不 同引物的 qPCR 扩增。
3. RT mix 中含除酶、模板和引物以外的 RT 成分,简化了反应设置步骤。
4. qPCR mix 是 2×预配液,也简化了反应设置步骤。
5. qPCR mix 含 qPCR 染料,无需另外加入相关荧光 PCR 染料。
6. 扩增效率高, 最长可扩增 5 Kbp 以上的 RNA。
7. 提供定量 PCR 专用模板稀释液,保证在制作标准曲线时低浓度样品的准确性。
规格及成分 成 分 编 号 十孔盒包装
2×RT Mix 60906a 40 uL(黄盖)
MMLV 逆转录酶 (含 RI) 60906b 10 uL(红盖)
2×qPCR MagicMix 90805 1 mL(棕色管)
定量 PCR 专用模板稀释液 180701 1 mL(绿盖)
RNase-free 水 80403 1 mL(蓝盖)
使用手册 101219sc 1 份
运输及保存 低温运输,-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂 样品 RNA、PCR 引物、ROX 染料 使用方法
一、样品 RNA 的制备(本试剂盒不提供相关试剂)
1、可用自本公司各种 RNA 提取方法提取样品的 RNA,也可以选用其他供应商的产品,但 得到的 RNA 一定要溶解在 RNase-free 的超纯水中。
2、如果需要用 RNA 制备标准曲线,则需在此步用定量 PCR 专用模板稀释液将 RNA 样品 稀释不同梯度,并分别作为下步 RT 反应的模板。
3、由于污染的 gDNA 会严重影响 RNA 的定量,因必须彻底去除 RNA 样品中的 gDNA 污 染。用户可以另购 RNase-free DNase 来消化 RNA 样品,也可以合成只识别外显子的 引物。
二:RT(逆转录)反应合成 cDNA
4、按下表配制 RT 反应体系(10 uL 体系),在每个管中加入下列成分: 成分 加入量 总 RNA 100-500 ng 2×RT mix 4 uL MMLV 逆转录酶 1 uL RNase-free 水 补到 10 uL
5、42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。
6、85℃保温 5 秒以终止反应,然后放置在冰上待用。
7、合成的 cDNA 可以直接作为下步 qPCR 模板使用,不需要纯化。剩余样品可以放置在 -20℃长期保存。如果需要用 cDNA 制备标准曲线,则需在此步用定量 PCR 专用模板 稀释液将 cDNA 样品稀释不同梯度,并分别作为下步 qPCR 反应的模板。
三、qPCR(20 uL 体系)
8、在每个 PCR 管中加入下列成分: 成分 加入量 qPCR MagicMix 10 uL cDNA 样品(来于上步的 RT 反应) 2 uL PCR 正向引物(10 pmol/uL) 1 uL PCR 反向引物(10 pmol/uL) 1 uL 自备 ROX 染料 I 或 II(见注) 2 uL RNase-free 水 4 uL
注意:如果使用 ABI 公司的 7500,7700 和 7900 三种型号的荧光 PCR 仪器,则需 用自备的 ROX 进行 Ct 值校正。对 ABI 7700 和 7900,ROX 的佳浓度为 1×(即 在每 20 uL 反应体系中加 2 uL 10×ROX)。对 ABI 7500, ROX 的佳浓度为 0.05-0.1×(每 20 uL 反应体系加 0.1-0.2 uL 10×ROX;也可将 10×ROX 稀释到 1×,然后每个反应体系加入 1-2 uL 1×ROX)。ROX 会在溶解曲线中产生噪音,因 此,如果出现了杂峰,将软件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”选项取消打 勾,然后重新分析数据。 对于iCycler IQ,MJ Opticon,MJ Chromo4,MX3000,MX4000, RotorGene3000, RotorGene 6000 和 LightCycler 480 等型号的荧光 PCR 仪器,ROX 不是必须的, 但加入的话也不会影响整个 PCR 分析。
9、PCR 反应参数(需要用户根据模板和引物决定,下面参数的只做参考): 过程 温度 时间 预变性 94℃ 5 min PCR 反应 (40 个循环) 94℃ 1 min 55℃ 1 min 72℃ 2 min 后延伸 72℃ 10 min
10、 实验结果分析:反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线,制作标准曲线。具体方法 随仪器不同而不同,请参考 qPCR 仪器手册。
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