供货周期: | 现货 |
品牌: | LMAI Bio |
规格: | 1mL |
货号: | LM-F294 |
CAS号: |
一步式探针法qRT-PCR试剂盒
产品及特点本产品是基于荧光探针检测的即用型 RT-PCR 试剂盒,可以对靶 RNA 分子进行实时定量
RT-PCR 分析(quantitative RT-PCR、qRT-PCR)。产品含有经过优化的缓冲液组分、逆转
录酶、热启动 Taq DNA 聚合酶、Taq DNA 稳定剂、dNTPs、MgCl2和稳定剂等所有实时定
量 RT-PCR 所需要的成分,用户只需加入 RNA 模板、引物和探针即可进行探针法实时定量
RT-PCR 反应,具有广泛的用途。本产品具有下列特点:
1. 以 2×Mix 提供,用户只需准备模板、引物、探针和 ROX 染料(取决于 qPCR 仪器)即
可以进行探针法实时定量 RT-PCR 实验,非常方便快捷,降低了操作误差。
2. 各成分的浓度和比例都经过精心优化,反应的灵敏度高,特异性强。灵敏度最高时可以达
到 50 拷贝/反应(跟模板质量,引物设计等相关)。
3. 既可用于TaqMan探针qRT-PCR,也可以是分子信标(molecular beacon)的qRT-PCR。
4. 灵敏度和专一性比染料法荧光定量 RT-PCR 更高。
5. 可用于基因表达分析、SNP 分析、拷贝数分析等实验。也可以用于定性检测。
6. 本产品只能用于科研,1mL 足够 100 次 20uL 体系的探针法 qRT-PCR 反应。
规格及成分 1 mL 规格成 份 编 号 塑料袋包装
2×探针法 qRT-PCR 缓冲液 LM190504a 1 mL(橙色盖)
5×探针法 qRT-PCR 酶混合液 LM190504b 0.2 mL(红色盖)
使用手册 LM190504sc 1 份
10mL 规格
成 份 编 号 十孔盒包装
2×探针法 qRT-PCR 缓冲液 190504a 1 mL×10(橙色盖)
5×探针法 qRT-PCR 酶混合液 190504b 0.2 mL×10(红色盖)
使用手册 190504sc 1 份
运输及保存 低温运输,-20℃保存, 不冻融时保存期限为 12 个月。如果需要每天使用,可在 4℃放置三周。
自备试剂 RNA 模板、引物、TaqMan 探针、超纯水。
使用方法
1. 如果有 N 个样品并且做定量分析,最好设置 N+7 个反应,多出的 7 个中,6 个是做标准
曲线的阳性对照,一个是阴性对照(NC)。在 N+7 个 PCR 管中,加入下列成分。如果是
做定性分析,则 6 个做标准曲线的样品缩减成一个阳性对照(PC),用户自己需要根据下
表进行适当修改(把 6 个标曲
2×探针法 qRT-PCR 缓冲液 各 10 uL 各 10 uL 10 uL
自备引物 1(10uM) 各 1 uL 各 1 uL 1 uL
自备引物 2(10uM) 各 1 uL 各 1 uL 1 uL
N 个自备模板 RNA 各 1-2 uL 不加 不加
自备阳性对照模板(6 个梯度) 不加 各 1 uL(1 管
加 1 个梯度) 不加
阴性对照模板(水) 不加 不加 1 uL
自备探针(0.5uM) 各 1 uL 各 1 uL 1 uL
自备 50×ROX I 染料
或
自备 50×ROX II 染料(见注)
各 0.4 uL 各 0.4 uL 0.4 uL
5×探针法 qRT-PCR 酶混合液 2 uL 2 uL 2 uL
补超纯水到 20 uL 20 uL 20 uL
注,下列信息仅供参考,具体以 qPCR 仪器的使用手册为准。
1、不需要 ROX 的机型:Agilent MX3000 和 MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、,、
Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System 等型号的荧光 PCR 仪器
不需要加 ROX 染料,但加入的话也不会影响整个 PCR 分析。
2、需要使用 ROX I 的机型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、Step
One Plus。
3、需要使用 ROX II 的机型:ABI Prism7500、7500 Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、
Corbett RotorGene 3000。
2. 放入荧光 PCR 仪中进行扩增, 下表的扩增参数仅供参考,一定需要根据靶分子长度,引物
和探针的 Tm 值、标记染料的种类等进行调节。一般选择三步法 PCR:
步骤 反应参数 备注
逆转录(RT 步骤) 94℃ 30 分钟
预变性 94℃ 2 分钟
PCR(35-45 次循环)
94℃ 15 秒
靶分子 长 度 最 好 在
80-200bp
55-65℃ 15-30 秒
在此步采集荧光信号,通
道根据标记染料决定
72℃ 30 秒
如果引物 Tm 值接近 60℃,也可以选择两步法 PCR:
步骤 反应参数 备注
逆转录(RT 步骤) 94℃ 30 分钟
预变性 94℃ 2 分钟
PCR(35-45 次循环)
94℃ 15 秒
靶分子 长 度 最 好 在
80-200bp
60℃ 30-60 秒
在此步采集荧光信号,通
道根据标记染料决定
3. 数据处理
如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘
制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值,再推算
出其浓度。
如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性。一般情况下,阴性对照 Ct 大于或等
于 40(阈值需要以阴性对照的 Ct 值确定,此处为便于叙述以 40 为例,具体情况很可能
阈值不一样)。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于 30。
对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在
35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 40,
则为阳性。
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