供货周期: | 现货 |
品牌: | LMAI Bio |
规格: | 50次 |
货号: | LM-F409 |
CAS号: |
动植物膜蛋白微量制备试剂盒
产品及特点 细胞膜蛋白质参与了很多重要的细胞活动,根据它们与膜结合的位置一般分为两种,一种是附着在细胞膜上,另一类是嵌入到细胞膜中间。附着型膜蛋白疏水性较弱,比较容易提取和纯化;而嵌入型膜蛋白疏水型很强,所以在水溶液里面很难溶解,非常难以提取和纯化。天恩泽基因根据上述特点,经过精心优化的、开发出本产品,专门用于分离纯化这两种膜蛋白。它具有下列特点:
1. 两步法提取,先纯化含膜组分,再分离附着型膜蛋白和嵌合型膜蛋白。
2. 膜蛋白(附着型+嵌入型)产量高,对肝脏组织而言,其线粒体膜蛋白产率为 10 ug/mg 左右,过氧化物酶体为 1 ug/mg 左右,内质网为 25-30ug/mg。
3. 所得的膜蛋白大部分具有生物活性,可用于活性研究。
4. 可用动物、植物培养细胞和实体细胞为材料,也可用预先纯化的含膜组分或细胞器(如线粒体、叶绿体、内质网、过氧化物酶体)为材料(本试剂盒不含纯化细胞器的试剂)。
5. 本方法重复性好。
6. 本试剂盒足够 50 次微量提取,分 A 型和 B 型两种。A 型用于附着型膜蛋白,B 型用于嵌合型膜蛋白和附着型膜蛋白。
运输及保存 常温运输及保存,有效期一年。
自备试剂 PBS,电泳上样液。
使用方法 1、 对培养细胞:收集 1×107 个培养细胞(动物细胞、植物细胞),用 20 mL自备的冰浴的 PBS 洗涤三次,每次洗涤后需要 4℃下 1000 g 离心 2 分钟,然后小心弃上清。对实体组织:由于各种动植物的各种实体组织的属性差别太大,故本手册的纯化膜组分的操作步骤(第 1-7 步)不一定完全适合,用户需要自行优化以纯化含膜组分或含膜的细胞器(如细胞质膜、内质网、线粒体、叶绿体等),再将含膜组分或细胞器沉淀直接用于第 8 步的膜蛋白提取。
2、 将洗涤后的细胞沉淀重悬在 2 mL 溶液 A 中,冰上静置 10 分钟。注意:膜蛋白有膜的保护,在纯化过程中对蛋白酶的降解没有胞浆蛋白敏感,一般可以不加蛋白酶抑制剂。但如果纯化的膜蛋白的确有降解的话,可以在溶液 A 中加入自备的蛋白酶抑制剂混合物。
3、 转移到容积为 2 mL 的 Dounce 玻璃匀浆器上下匀浆 20-50 次(具体次数取决于细胞种类,293T 细胞一般需要 20 次左右,而 MEF 细胞一般需要50 次左右。用样品先进行预实验以摸索佳匀浆次数,佳匀浆次数时在显微镜下能看见细胞破裂但细胞核完整)。
4、 将匀浆液转移到 15 或 50 mL 塑料管中,加入相当于匀浆液体积 1/10 的溶液 B,其间可以轻柔颠倒混匀 3-5 次,留少量样品作为对照 1(匀浆液)。
5、 4℃ 2500 rpm 离心 20 分钟,沉淀为细胞核,上清为胞浆和膜成分,留少量样品作为对照 2(胞浆和膜成分)。
6、 将上清液用 Beckman Optima 台式超速离心机 100,000 g 4℃离心 60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机,但离心力应该为 100,000g,否则有可能得不到膜成分沉淀。
7、 小心转移上清(胞浆部分)并留少量样品作为对照 3(胞浆)。
8、 将沉淀(含膜组分)重悬于 1 mL 冰浴的溶液 C 中后,冰上静置 30 分钟,留少量样品作为对照 4(膜成分)。本成分电泳前,需要先用自备的 TCA沉淀(TCA 终浓度为 10%),再用冰冷的丙酮洗涤两次后再溶解在 1×上样液中待用。对照 1-3 号不需要这样的预处理。
9、 用 Beckman Optima 台式超速离心机 100,000g 4℃离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机,但离心力应该一致,否则有可能得不到沉淀。
10、如果需要附着型膜蛋白,则取上清(含附着型膜蛋白)弃沉淀(含膜和其中的嵌合型膜蛋白)。上清可以放-20℃长期保存,如果需要电泳,需要先用自备的 TCA 沉淀(TCA 终浓度为 10%),再用冰冷的丙酮洗涤两次后再溶解在 1×上样液中与对照 1-4 号一起上样电泳。
11、如果需要嵌合型膜蛋白,则取出上清(含附着型膜蛋白)并留少量样品作为附着型膜蛋白样品,然后再用 1 mL 冰浴的溶液 C 重悬沉淀,然后100,000g 4℃离心 60 分钟,去掉上清(上清含残留的附着型膜蛋白,可 以留样作为洗涤后的附着型膜蛋白样品)。沉淀含膜和其中的嵌合型膜蛋 白。如果需要测定膜蛋白的浓度,则将其溶解在自备的 0.5 M NaOH 溶液
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