供货周期: | 现货 |
品牌: | LMAI Bio |
规格: | 1600次 |
货号: | LM-F513 |
CAS号: |
AFLP试剂盒(EcoRI-MseI)
产品及特点AFLP(amplified fragment length polymorphism)原理是一种结合 RFLP 和 PCR 技术特点的、迄今为止最有效分子标记分型技术,其原理如下:本产品在传统 AFLP-PCR 的基础上经过精心优化而开发,它具有下列特点:
1. 一站式,足够 50 次酶切-连接反应、40 次预扩反应和 1500 次 AFLP PCR(30 uL体系计算),但不包括 DNA 纯化和带型分析试剂(如 PAGE 电泳试剂和银染试剂)。
2. 本系列产品提供 EcoRI-MseI 组合,适用于 GC 含量在 50%以上的基因组。对GC 含量在 50%以下的基因组,需从本公司采购 AFLP 的 EcoRI-TaqI 组合。
3. 各种参数都经过优化,一次 PCR 所得 AFLP 片段数一般在 10-100 之间,可重复性好,误差小于 0.6%。
4. 本产品适用于基因组在 500 Mb-6000 Mb 的材料(如动物和植物)。对于基因组在 50-500 Mb 的材料(如细菌和真菌)或 50Mb 以下的材料(如质粒,cosmid,BAC,YAC 和 PAC 等),需要分别另购+0 型预扩增引物对+2 型扩增引物。
规格及成分 成 份 编 号 小扁盒包装
AFLP 酶切-连接 Buffer,10× LM100903a 100 uL(绿盖)
AFLP EcoRI-MseI 酶混合液 100903b 50 uL(红盖)
AFLP EcoRI-MseI 接头混合物 100903c 1000 uL(黄盖)
T4 DNA 连接酶 120411 50 uL(蓝盖)
PCR MagicMix 3.0 90805 5 mL×6(塑料袋)
+1 型 EcoRI-MseI 预扩增引物对 100903d 500 uL(白盖)
+3 型 EcoRI 引物(8 条) 100903e 十孔盒 1
+3 型 MseI 引物(8 条) 100903f 十孔盒 2
使用手册 100903sc 1 份
运输及保存 低温运输、-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂 超纯水、Southern 级 DNA 纯化试剂,尿素-PAGE 电泳套装,银染试剂盒。
使用方法
一、 DNA 提取(本试剂盒不提供相关试剂)用户需要自备 50-500ng Southern 级别的基因组 DNA,DNA 酶切彻底是 AFLP 的关键,所以好预实验以确保 DNA 能够被 EcoRI 和 MseI 内切酶彻底切开。
二、 限制性酶切和接头连接反应(本试剂盒足够 50 次 20uL 体系的酶切-连接反应)
1. 在 0.2 mL 离心管中设置 20 uL 的限制性内切酶酶切体系:
成分 用量
AFLP 酶切-连接 Buffer,10× 2 uL
样品 DNA
50 ng(对小基因组材料)
500 ng(对大基因组材料)
AFLP EcoR I-Mse I 酶混合液 1 uL
自备超纯水 加水到 20 uL
2. 轻柔混匀并短暂离心后,37℃保温 2 小时酶切(若 PCR 仪器不带热盖,则必须加 50uL自备石蜡油,否则水分会蒸发影响反应。下同)。反应结束后 70℃保温 15 分钟灭活酶。
3. 在体系中加入 20 uL EcoRI-MseI 接头混合物和 1 uL T4 DNA 连接酶,轻柔混匀并短暂离心,20℃保温 2-3 小时让接头跟酶切 DNA 片段相连。
4. 反应结束后在 40uL 的连接反应体系中加入自备 360uL超纯水,得到连接液10 倍稀释液,直接作为模板用于下步的预扩增或放-20℃保存待用。
三、 预扩增(本试剂盒足够 40 次 30uL 体系的预扩增反应)
5. 在 0.2 mL 离心管中设置 30 uL 的预扩 PCR 体系:成分 体积
连接液 10 倍稀释液(来于第 4 步) 5 uL
+1 型 EcoRI-MseI 预扩增引物对 10 uL
PCR MagicMix 3.0 15 uL
20180925dx
6. 离心数秒,按下列参数进行 PCR 预扩增(注意:一步是预合成,跟常规 PCR 不同):预合成 72℃ 2 分钟,PCR 循环 20 次(94℃30S,56℃60S,72℃60S)
7. 取 10 uL PCR 产物在 1.5%琼脂糖胶上电泳检测,产物应为大小在 100-1500 bp 的模糊条带。本试剂盒的 PCR mix 含上样液和示踪染料,故不需要额外加 Loading Buffer。示踪染料的泳动速度相当于 50bp 的 DNA 片段。
8. 在剩下的 20uL 预扩增反应液中加入 980uL 自备超纯水,相当于稀释 50 倍,所得 50 倍PCR 稀释液,直接作为模板用于下步扩增或放-20℃保存待用。
四、选择性 PCR 扩增9. 制备引物:在十孔盒 1 和十孔盒 2 的共 16 管引物干粉中分别加入 1100uL 自备超纯水,震荡混匀得 16 管引物母液。每管取 66uL 引物母液与 1034uL 超纯水在 1.5mL 离心管中混合得 1100uL 此引物的工作液,共 16 管引物工作液。
10. 在 0.2 mL PCR 管中,加入下列成分(一次 PCR 时需要测试所有 8×8=64 种引物组合,需设置 64 个 PCR 反应。若已经知道哪个一种或几种引物组合适合,则可以直接使用
选中的引物),下面以一种 3 型 EcoR I 引物和+3 型 Mse I 引物组合为例:
成分 体积
50 倍 PCR 稀释液 5 uL
AFLP+3 型 EcoR I 引物工作液(八种之一) 5 uL
AFLP+3 型 Mse I 引物工作液(八种之一) 5 uL
PCR MagicMix 3.0 15 uL
11. 轻柔混匀后离心数秒,按下列参数进行 PCR:
温度 时间
PCR(13 次)
94℃ 30 秒
65℃ 30 秒(每次循环递减 0.7℃)
72℃ 60 秒
PCR(23 次)
94℃ 30 秒
55℃ 30 秒
72℃ 60 秒
延伸 72℃ 5 分钟
四、 尿素-PAGE 电泳和银染(需另购试剂并按相关手册进行)
12. PCR 结束后进行尿素-PAGE 电泳和银染分析。
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