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目录
/CONTENT
01/介绍
02/内部补料策略
1.扩散控制补料
2.酶控补料
3.内部补料策略小结
03/外部补料策略
1.自动化液体处理系统
2.用于分批补料微生物反应器系统的微流体和微型阀技术
3.外部补料策略小结
04/结论
前言
先进的分批补料微生物反应器可降低扩大规模的风险,并更接近模拟工业培养实践。近年来,已经开发了高通量微量补料策略,无论实验预算如何,都可以提高微量分批补料培养的可及性。该综述探讨了这些技术及其在加速生物过程开发中的作用。扩散和酶控制的补料可实现基质的连续供应,且简单实惠。更复杂的补料曲线和更强的过程控制需要额外的硬件。自动液体处理机器人可被编程为预定义的补料曲线,并具有响应过程参数偏差的灵敏度。
研究显示,微流体技术可促进连续和精确补料。将自动化高通量分批补料培养与实验设计和基于模型的优化相结合的整体方法极大地增强了过程理解,同时最大限度地减少了实验负担。为在线优化补料条件引入实时数据可进一步细化筛选。尽管该综述中讨论的技术有望实现高效、低风险的生物过程开发,但自动化培养平台的费用和复杂性限制了其广泛应用。未来的关注点应该集中在开源软件的开发上,减少硬件的排他性。
01
介绍
02
内部补料策略
在内部分批补料系统中,基质在培养容器内逐渐释放,无需外部补料。这些系统的主要特点是它们与现有基础设施的兼容性。由于不需要先进的微型泵、微流体或液体处理机器人技术,因此可以显著降低成本和复杂性。这种系统通常利用扩散或催化现象。
2.1扩散控制补料
扩散控制进料涉及将截留的营养物从聚合物吸附剂或通过人工膜缓慢释放。培养基中的营养物质扩散穿过半透性透析膜,然后被细胞利用。Philip 等人 2017年阐明了作为影响补料速率的关键因素的两个参数,储器中的初始基质浓度和膜几何形状。这有助于更好的补料速率控制,并且发现尽管培养体积放大了 100 倍。然而,使用透析膜的扩散控制补料方法的一个主要限制是其对摇瓶培养的限制, 这限制了生产量。
Jeude等人2006 年开发了 FeedBead®技术,这项技术最初也是为了在摇瓶中使用而开发的,但 Scheidle 等人 2009 年证明了 FeedBead®技术适用于 MTP 应用。Keil 等人于 2019 年开发了一种 MTP FeedPlate®系统,该系统在每个孔的底部包含一个固定的固体有机硅基质和嵌入的葡萄糖晶体。在这些 FeedPlates®中,GFP 产量提高了 245 倍。该板以 24、48 或 96 孔形式上市,允许以分批补料模式直接进行高通量培养。然而,培养基 pH、温度和渗透压等外部因素对葡萄糖释放速率有主要影响。因此,使用该技术时,对基质释放速率的精确控制受到限制。
2016 年,Flitsch 等人研发了一种改进的 μ-RAMOS 设备,其目的是克服原始设备的瓶颈。更新后的系统在 48 孔 MTP 的每个孔中配备了气体入口和出口阀以及光学传感器,便于对所有 48 种培养物同时进行 OTR 监测。该技术最近被进一步扩展用于 96 孔深孔 MTP,使研究人员能够实现比原始摇瓶规模的RAMOS 系统增加 15 倍的实验通量。Habicher 等人 2020 年证明了最先进的 μ- RAMOS 和 FeedPlate®对于工程化用于蛋白酶生产的地衣芽孢杆菌菌株的葡萄糖限制培养的兼容性。OTR 的在线监测极大地改善了 MTP 培养物的信息含量,发现其在 MTP 和摇瓶规模下的性能相当。使用该平台生成的数据可用于在开发的最早阶段生成数学模型,从而根据设计原则显著改善了过程质量。
Wilming 等人 2014 年使用 96 孔 MTP 开发了一种替代的基于扩散的分批补料系统。每个培养孔通过填充有聚丙烯酰胺水凝胶的扩散通道连接至储层孔,便于每个平板进行多达 44 次平行分批补料培养。用浓缩基质溶液填充储器,以实现逐步扩散驱动补料。通过改变储器中的浓度并由此改变驱动浓度梯度。然而, 发现补料浓度和葡萄糖释放速率之间的关系是非线性的。这种使补料速率微调复杂化的非线性归因于水的反向扩散。尽管如此,板的透明底座提供了与板读取技术兼容的主要优势,例如用于通过散射光测量生物量和荧光的 BioLector 系统(mp2-Labs,德国)。使用该系统证明了大肠杆菌和多形嗜血杆菌菌株的分批补料培养。与分批对照相比,用最佳 300g/L 葡萄糖补料进行大肠杆菌的分批补料培养分别导致生物量和基于黄素单核苷酸的荧光报告蛋白信号增加约5 倍和14 倍。
2.2酶控补料
淀粉在液体培养基中的溶解度差,需要在原始 EnBase®工艺中使用固相。为了消除对双相系统的需求,开发了具有完全可溶性聚合物基材的 EnBase® Flo。葡萄糖释放方法与矿物盐和复杂培养基添加剂的精心优化组合相结合,以产生高细胞密度和产品滴度。Glazyrina 等人 2012 年通过在 3mL 至 60L 的范围内培养经工程改造过量生产模型酶醇脱氢酶的大肠杆菌菌株,研究了 EnBase® Flo 系统的可扩展性。在所有测试规模下均实现了相当的增长率和蛋白质滴度,突出了可扩展性。在所有测试规模上都实现了可比的生长速率和蛋白质滴度,突出了可扩展性。EnBase®系统还提供了在大型生物反应器的初始培养阶段控制葡萄糖释放的额外好处,完全消除了溢出代谢。
EnBase®技术还以方便的片剂形式在市场上销售。该 EnPresso®系统与 D- optimal DoE 方法相结合,可优化 24 孔板中工程大肠杆菌的缬诺霉素生产。与原始分批培养相比,DoE 驱动的平行分批补料培养策略使缬氨霉素滴度提高了 33 倍。
2.3内部补料策略小结
扩散和酶控制的补料策略提供了一种相对简单和低成本的方法来模拟更大规模的分批补料过程。它们提供了恒定基质补料的关键优势,但在整个培养过程中通常不可能精确控制补料速率。结果,更复杂(例如指数)的进给曲线不能使用内部补料策略。此外,补料通常限于单一基质,这可能导致培养基中的其他营养物变得有限。特别是基于酶的补料依赖葡萄糖作为碳源,这可能不是所有过程的最佳选择。此外,在此类系统中,酸和碱补料通常是不可能的,从而限制了过程控制能力。
曼森平行生物反应器分批补料应用
曼森采用Watson-malow 400A高精度泵头,16 路补料,平均每个罐有四路补料,蠕动泵流量可设定,连续可调;每个蠕动泵的功能可单独分配,可以作为酸泵、碱泵、补料泵、消泡泵、液位控制泵。
未完待续
信息来源:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0734975021001944?ref=pdf_dow
nload&fr=RR-2&rr=747c4db53ee4ddb1
Mediacenter Editor | 曼森编辑
文章来源:本文由中科院上海生命科学信息中心与曼森生物合作供稿
排版校对:刘娟娟编辑
内容审核:郝玉有博士
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