厚朴为木兰科植物厚朴或凹叶厚朴的干燥干皮、根皮及枝皮,含有大量的树脂类、挥发油类成分,这些成分对GCMSMS分析中个别农残化合物保留时间漂移严重,LCMSMS分析中个别农残化合物干扰大,农残线性和回收率较差。药典推荐的固相萃取法一、固相萃取法二、固相萃取法三和快速样品处理法都不能很好的净化。
纳谱分析近期针对上述含树脂类、挥发油类样品分析存在的问题,在改进填料的吸附能力的同时,分别推出适用于高油脂中药的快速样品处理法的净化管和固相萃取法二。相比传统净化方式,优化后的前处理材料可以有所针对性的吸附更多色素、挥发油类成分,从而降低了样品中色素对色谱柱的污染和挥发油类造成的基质效应,有效的提高了厚朴样品分析时农残目标物的准确性。
今天,我们来看看厚朴项目的前处理效果吧。
实验原理
本方法参考中国药典2020版2341第五法中的快速样品处理法和固相萃取法2,适用于含有挥发油、树脂类基质干扰大和色素较多的中药材农残检测。
实验步骤
对照品溶液的制备
1.1 混合对照品配制
精密量取禁用农药混合1mL,置20mL量瓶中,加乙腈稀释至刻度,摇匀,备用;
1 .2 气相色谱-串联质谱法分析用内标溶液的制备
取磷酸三苯酯对照品适量,精密称定,加乙腈溶解并制成每1mL含1.0mg的溶液,即得。精密量取适量,加乙腈制成每1mL含0.1μg的溶液。
1.3 空白基质溶液的制备
取空白基质样品,同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。
1.4 基质混合对照溶液的制备
分别精密量取空白基质溶液1.0mL(6份),置氮吹仪上,40°C水浴浓缩至约0.6mL,分别加入混合对照品溶液10μL、20μL、50μL、100μL、150μL、200μL,加乙腈稀释至1mL,涡旋混匀,即得。
二
供试品溶液的制备
法
HLB法
一
“
1
提取
直接提取法:
精密称取5g样品(3号筛),加氯化钠1g,加入50mL乙腈,匀浆处理2分钟,离心后分取上清液,残渣再加50mL乙腈,匀浆处理1分钟,离心后,合并两次提取上清液,减压浓缩至3~5mL,加乙腈定容至10mL,摇匀,置-20℃冷藏3h或家用冰箱冷藏过夜,取出趁冷离心1min,所有上清液转移至新的离心管中放置至室温,待净化。
“
2
HLB法净化
GCMSMS样品:
SPE柱:SelectCore HLB-A中药农残专用柱200mg/6mL
净化:量取上述厚朴提取液5mL(直接提取法),过SelectCore HLB-A中药农残专用柱200mg/6mL,收集全部净化液,混匀,即得。
GC/MS/MS测定:精密量取过固相萃取柱氮吹定容后的溶液1mL,氮吹至0.4mL加入混合对照溶液,乙腈定容至1mL,再加入0.3 mL磷酸三苯酯溶液,混匀,过0.22μm尼龙针式过滤器,上机分析。
LCMSMS样品:
SPE柱:SelectCore HLB-B中药农残专用柱200mg/6mL
净化:量取上述厚朴提取液3mL(直接提取法),过SelectCore HLB-B中药农残专用柱200mg/6mL,收集全部净化液,混匀,即得。
LC/MS/MS测定:精密量取过固相萃取柱后溶液1mL氮吹至0.4mL加入混合对照品液,乙腈定容至1mL,再加入0.3 mL水,混匀,过0.22μm尼龙针式过滤器,上机分析。
法
QuEChERS法
二
▼
“
1
提取
取供试品粉末(过三号筛)1.5g,精密称定,置50mL聚苯乙烯具塞离心管中,加入1%冰醋酸溶液15mL,涡旋使药粉充分浸润,放置30分钟,精密加入乙腈15mL,涡旋使混匀,置振荡器上剧烈振荡(500次/分)5分钟,加入盐包(QS-002),立即摇散,再置振荡器上剧烈振荡(500次/分)3分钟,于冰浴中冷却10分钟,离心(每分钟4000转)5分钟,待净化。
“
2
QuEChERS法净化
SPE净化管:Q-15A06 SelectCore QuEChERS净化管15mL,Pesticide Residue A06(含色素挥发油中药农残Q法)
净化:取上述提取液上清液9mL置Q-15A06净化管中涡旋使充分混匀,置振荡器上剧烈振荡(500次/分)5分钟使净化完全,离心(每分钟4000转)5分钟,即得。
GC/MS/MS测定:精密吸取上清液5mL,置氮吹仪上于35℃水浴浓缩至约0.4mL,加入混合对照品液再加乙腈稀释至1.0mL,涡旋混匀,再加入0.3 mL磷酸三苯酯溶液,混匀,过0.22μm尼龙针式过滤器,上机分析。
LC/MS/MS测定:精密吸取上清液5mL,置氮吹仪上于35℃水浴浓缩至约0.4mL,加入混合对照品液再加乙腈稀释至1.0mL,涡旋混匀,再加入0.3 mL水,混匀,过0.22μm尼龙针式过滤器,上机分析。
注意:样品浓度为0.5g/mL。
三
HLB法处理后溶液的颜色比对
从左至右分别是厚朴提取液、厚朴取液过SelectCore HLB-A 200mg/6mL小柱、厚朴提取液过SelectCore HLB-B 200mg/6mL小柱
四
气相色谱-串联质谱法
(岛津 GC-MS -TQ8040 NX)
色谱条件
色谱柱:SHIMADZU SH-Rxi-17Sil MS,30m×0.25mm, 0.25μm;
进样口温度:250℃;
升温程序:初始温度为60℃,保持1min;以10℃/min升温至160℃;再以2℃/min升温至230℃,最后以15℃/min升温至300℃,保持6min;
载气:高纯氦气(纯度>99.999%);
进样方式:不分流进样;
恒压模式:146kPa;
进样量:1μL。
质谱条件
电离方式:电子轰击电离源(EI);
电离能量:70Ev;
接口温度:250℃;
离子源温度:250℃;
监测方式:多反应检测模式(MRM);
溶剂延迟:10.0min。
五
高效液相色谱-串联质谱法
(岛津 LC-MS 8045)
色谱条件
色谱柱:ChromCore C18-MS Pesticides中药农残专用柱(2.1 ×100 mm,2.6μm)
流动相:
A:0.1%甲酸水溶液(含有5mmol/L甲酸铵)
B:乙腈-0.1%甲酸水溶液(含有5mmol/L甲酸铵)=95:5
梯度:
时间 (min) | 流速 (mL/min) | 流动相A (%) | 流动相B (%) |
0 | 0.3 | 70 | 30 |
1 | 0.3 | 70 | 30 |
12 | 0.3 | 0 | 100 |
14 | 0.3 | 0 | 100 |
14.1 | 0.3 | 70 | 30 |
16 | 0.3 | 70 | 30 |
流速: 0.3mL/min
柱温: 40℃
进样量: 2µL
质谱条件
离子源: 电喷雾离子源(Electrospray ionization,ESI)正离子扫描
监测方式:多反应监测(Multiple Reaction Monitoring,MRM)
离子源接口电压:4.5kV
雾化气:氮气3.0L/min
加热气:干燥空气10.0L/min
DL温度:250℃
加热模块温度:400℃
接口温度:300℃
干燥气:N2 10L/min
六
HLB法净化后化合物出峰情况
厚朴基质加标LCMSMS氟虫腈类和甲基硫环磷出峰情况
氟虫腈
氟甲腈
氟虫腈砜
氟虫腈亚砜
甲基硫环磷
七
添加回收率
法
HLB法
一
表1 厚朴HLB法33种农药残留的的测定添加回收结果(%)
HLB法净化检测目标物注意事项:
GCMSMS:
氟虫腈类化合物偶见保留时间漂移,需要重新定位后再创建MRM方法分析,或采用LCMSMS分析;
除草醚保留时间往后漂移1.5min左右(参考);
甲基对硫磷参考离子可选用:125.0>47.0 CE:10,响应较高。
久效磷、杀虫脒、水胺硫磷、苯线磷、甲基硫环磷均参考LCMSMS结果。
LCMSMS:
目标物 | 定量离子 | CE电压 | 参考离子 | CE电压 | msec | 保留时间(参考) |
氟虫腈 | 434.90>81.00 | 15 | 434.90>249.80 | 30 | 5 | 7.341 |
氟甲腈 | 386.90>350.80 | 10 | 386.90>281.80 | 35 | 5 | 7.656 |
氟虫腈砜 | 450.90>281.80 | 30 | 450.90>243.80 | 66 | 5 | 8.093 |
氟虫腈亚砜 | 419.10>383.10 | 10 | 419.10>262.10 | 27 | 5 | 8.103 |
水胺硫磷 | 291.00>231.00 | -15 | 291.00>121.00 | -30 | 5 | 5.106 |
甲基硫环磷 | 228.00>168.10 | -19 | 228.00>108.9 | -33 | 5 | 0.886 |
以上目标物中氟虫腈类化合物均为负离子模式采集,甲基硫环磷和水胺硫磷为正离子模式采集。
由于分析化合物多,且存在正负离子模式同时采集,为提高仪器灵敏度可采用分段采集模式进行,分段采集可设置测定时间为各目标物保留时间前后各0.5min。
挥发油基质样品自动进样器托盘温度不宜过低,否则个别样品会出现分层,导致分析结果不准确,建议25℃为宜。
法
QuEChERS法
二
表2 厚朴QuEChERS法33种农药残留的的测定添加回收结果(%)
QuEChERS法净化检测目标物注意事项:
GCMSMS:
杀虫脒可增加离子通道:180.9>140.0 CE:15,195.9>152.0 CE:15来辅助定性;
水胺硫磷定量离子为:229.7>211.7;
2,4'-滴滴涕定量离子为:237.0>199.0;
除草醚保留时间往后漂移1min(参考);
β-硫丹和硫丹硫酸酯保留时间往后漂移1.5min(参考);
苯线磷、内吸磷、甲基硫环磷、氟虫腈砜参考LCMSMS分析结果。
LCMSMS:
涕灭威亚砜定量离子为:207.1>89.0;
水胺硫磷定量离子为:291.0>231.0 CE:-15
目标物 | 定量离子 | CE电压 | 参考离子 | CE电压 | msec | 保留时间(参考) |
氟虫腈砜(-) | 450.90>281.80 | 30 | 450.90>243.80 | 66 | 5 | 8.093 |
甲基硫环磷(+) | 228.00>168.10 | -19 | 228.00>108.9 | -33 | 5 | 0.886 |
八
实验讨论
通过以上实验数据可以看出,SelectCore HLB-A 200mg/6mL固相萃取柱净化后的厚朴样品溶液颜色较浅,减少了污染GCMSMS柱前端的风险。SelectCore HLB-B 200mg/6mL固相萃取柱对厚朴中挥发油类成分祛除效果良好,减轻了由于基质中干扰物导致的LCMSMS上样品中部分目标物响应低的问题。这两款农残专用固相萃取柱,针对厚朴中色素、挥发油类成分去除效果良好。同时,我们也提供了Q法的净化方案,Q-15A06 SelectCore QuEChERS净化管15mL,Pesticide Residue A06(含色素挥发油中药农残Q法)对QuEChERS法提取的样品中挥发油、色素类成分祛除效果较好。搭配上述解决办法有效的提高了实验效率,也为厚朴的农药残留实验数据的稳定性和可靠性提供了良好的帮助。
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