【知识分享】液相梯度分析中鬼峰的由来及解决方案

纳谱分析技术(苏州)有限公司

2024/10/18 11:52

在液相色谱分析中，开发梯度方法时经常会遇到这样的问题：空白溶剂进样（或零体积进样）也会在基线上出现许多色谱峰（鬼峰），从而干扰分析，这些未知的色谱峰尤其在低波长和梯度变化较快时更容易出现。而在方法开发中，为了消除鬼峰干扰所需要耗费的精力和时间也是巨大的，消除鬼峰无疑是一项非常棘手的工作。

我们可以从了解高效液相色谱（HPLC）的梯度洗脱机制来理解鬼峰产生的原由。

在反相HPLC中，梯度开始时，流动相的洗脱能力较弱，即有机相的比例较低。因此，流动相中含有的任何疏水性物质都可能保留在分析柱头的固定相上（图1）。

图1.HPLC梯度开始时，疏水性物质在色谱柱柱头被吸附保留

随着梯度过程中流动相的洗脱强度增加，分析物谱带开始通过柱床迁移，谱带“前部”（离检测器最近）的洗脱强度始终略弱于谱带“后部”（离进样器最近）的洗脱强度，因此会导致谱带的后部移动速度比前部移动得更快，分析物谱带在梯度运行中会被压缩（图2）。

这些流动相污染物会被梯度分析保留并随后聚集，最终在梯度洗脱分析的“空白”色谱图中显示为色谱峰（鬼峰）。而等度分析时，谱带不会被压缩聚集，这可能是等度条件不易出现鬼峰的原因。

流动相污染物的主要来源：

1、水

纯水仪中的水是纯净的，但如果没有得到适当的清洁和维护，去离子和纯化装置中的水很可能含有细菌。细菌会产生废物并分解产生大量紫外线活性化合物，这些化合物会在梯度分析中产生鬼峰。

2、流动相容器浸出物

1）流动相接触的设备，使用干净干燥的玻璃器皿，避免在流动相制备和储存过程中使用塑料设备；

2）自动进样器小瓶瓶盖内的隔膜，隔膜中的小碎片会沉积到样品液里，甚至挥发性样品可能会从完好无损的瓶盖中浸出增塑剂和其他成分。

3、有机溶剂

在进行痕量分析或使用较低紫外波长进行检测时，溶剂的质量变得尤为重要，不同品牌溶剂都有可能会存在痕量杂质带来鬼峰干扰。

4、试剂和添加剂

缓冲盐的纯度范围很广，其中有些不适合HPLC。乙酸铵等潮解盐的纯度可能会随着时间的推移而降低，塑料瓶和塑料盖为包装的盐可能会受到浸出物的影响。避免使用质量较差的盐类和添加剂，尽可能避免在塑料瓶中储存或评估浸出物的影响，并仔细控制储存条件和保质期。使用更纯净的流动相添加剂，并运行检查梯度以评估流动相添加剂导致鬼峰的可能性。

5、系统污染

系统中积累的样品污染物会随着有机相含量的变化而渗入流动相中，并通过梯度聚集在整个色谱图中形成色谱峰。必须确保定期清洁和维护系统中的易污染区域，例如针座、转子密封件和毛细链接管内表面。

6、柱流失

虽然大多数色谱柱在适当的操作条件下都相当稳定，但一些小基团键合相往往存在更高的流失问题。这类色谱柱使用和储存一定要遵循厂家建议。

鬼峰解决方案—鬼峰去除柱

纳谱分析特别研发出鬼峰小柱——NanoChrom Ghost-Remover鬼峰去除柱，能够去除流动相以及管路和混合器中的杂质，有效清除鬼峰干扰，从而大大缩短方法验证和微量、痕量物质的分析时间。对于药物分析研发人员而言，NanoChrom Ghost-Remover鬼峰去除柱是您必备的鬼峰消除神器。