供货周期: | 现货 |
品牌: | 钦诚生物 |
规格: | 20次 |
货号: | QC60603-20 |
CAS号: |
即用型蓝白T载体A型(T7-SP6,有MCS)
英文名称:
运输:低温
保存:负20度
有效期:1年
货期:1-2天
其他:
产品及特点
本产品是用Xcm I酶切环状的可保种型蓝白T载体去掉一段1.3Kb
的插入片段后得到的线性DNA片段(载体部分),其两个末端的5’都有一个突出的T,
可以用于快速克隆具有加尾活性的耐热酶(如Taq DNA聚合酶)扩增得到的PCR片
段。
1. 由于是通过Xcm I酶切制备,所以载体两端的带T率为100%,远高于用Taq
DNA聚合酶和TdT末端转移酶在平末端载体加尾得到的T载体。
2. 克隆的阳性率一般在90%以上, 缩短了筛选过程。
3. 插入位点两侧有对称的常见酶切位点(如EcoR I),便于对克隆的PCR片段
进行近一步的分析。
4. 克隆位点两侧分别有T7和T3 RNA聚合酶启动子, 便于用克隆的PCR片段制
备RNA探针。
5. 可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。
6. T克隆位点位于β-半乳糖苷酶的α-肽编码区内,可以进行蓝白斑筛选。
7. 含有丝状噬菌体f1 复制起始子,可以制备单链DNA。
运输及保存 低温运输,-20℃保存,有效期两年。
自备试剂 连接反应试剂,超纯水
使用方法 一. PCR产物的纯化和定量
1. 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离。不要使用TBE缓冲液,因为它会
影响DNA的胶回收效率。
2. 在长波(360nm)紫外灯下快速切胶,尽可能切掉多余的凝胶。为避免嘧啶二
聚体的形成,可以使用天泽基因的DNA防护剂UV Eraso。
3. 用天泽基因的柱式DNABACK纯化回收PCR片段。溶解PCR
片段的超纯水体积越小越便于后续操作。
4. 将回收的片段与浓度已知的DNA Marker在含EB或绿如蓝
染料的琼脂糖凝胶中电泳,通过比较DNA条带的荧光强度
而估测PCR纯化产物的浓度。注意:一般不推荐使用测OD260的方法,因
为回收的DNA很珍贵,该方法需要比较多的DNA。
5. 如果所得的DNA片段浓度较低,可以使用本公司核酸浓缩剂将其浓缩到需要的浓度。
6. 如果PCR片段为平末端,则需要用加A试剂盒处理,否则不能用于与T载体的
连接反应。
二. 连接反应
1. 短暂离心装有T载体的离心管。
2. 在两个离心管中加入下列成分:
成份 样品管 负对照 正对照
自备 T4 Ligase Buffer,10× 1 uL 1 uL 1 uL
蓝白 T 载体(40 ng/uL) 1 uL 1 uL 1 uL
自备 PCR 纯化产物 (见下注) 不加 不加
阳性对照(40 ng/uL) 不加 不加 1 uL
自备 T4 Ligase(5-10 U/uL) 1 uL 1 uL 1 uL
补超纯水到 10 uL 10 uL 10 uL
注: PCR纯化产物与蓝白T载体的摩尔比为3-10,可以按下面的公式计算出
连接反应中需要的PCR 纯化产物的ng数:
加入载体的量(
ng) 插入片段大小(kb)
载体大小(kb) 插入片段和载体摩尔比
假如插入片段和载体的连接比例设定为3,连接反应中加入蓝白T载体(长度为3 Kb)
的量为40ng,则需要长度为0.5 Kb 的PCR 纯化产物的量是:
40 ng载体 0.5 kb插入片段
3
3.0 kb载体 20 ng插入片段
3. 用移液器吹打连接反应使之混匀后,16℃孵育12小时(或按T4 Ligase供货商
提供的操作手册进行连接)。
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