供货周期: | 现货 |
品牌: | 钦诚生物 |
规格: | 10次 |
货号: | QC101104-10 |
CAS号: |
3’RACE试剂盒
英文名称:3′-RACE Kit
运输:低温
保存:负20℃
有效期:1年
货期:1-2天
其他:
产品介绍:
克隆RNA的3‘端
产品及特点
研究真核基因的最基础的工作之一就是确定其转录终止位点,目前最通用的方
法是 3′-RACE 法,RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是 Frohman
发明的、通过 PCR 快速克隆 cDNA 末端的技术,它在不建立 cDNA 文库的前提下,
利用已知 cDNA 序列设计引物,通过往两端延伸和扩增获得其 3′-端序列。本试剂
盒就是根据 3′-RACE 原理而开发,它具有下列特点:
1. 即开即用,客户不需要单独准备各种材料。
2. 反应条件经过精心优化,包括使用无 RNase H 活性的 MMLV 和优化的引物。
3′-RACE 的原理如下图:
自备试剂 Poly(A) RNA(或总 RNA)、基因专一性引物 A、基因专一性引物 B、超纯水。
运输及保存 低温运输、-20℃保存、有效期一年。
使用方法 一:引物的设计和准备工作
利用已道序列的区域设计基因专一性引物三条(A、B),其中引物 B 和 A 引物
比较,靠 3’端 10-30 个碱基,类似巢式 PCR 的引物设计。自备的基因专一性引物
的 Tm 最好跟 3′-RACE 引物 B 和引物 C 的一致,即 Tm 为 58℃。引物合成后加
超纯水使其浓度为 10 μM,放冰上待用。
二:利用含 Oligo(dT)的 3’-RACE 引物 A 进行逆转录
注意:MMLV 酶使用前必须短暂离心,因为它含 50%甘油,及其粘稠,否则将取不
到所需体积。
1. 在一个 PCR 管中,加入以下组分:
成分 用量
Poly(A) RNA(或总RNA ) 0.2-2 μg(5 μg)
3′-RACE引物A(10 μM) 1 μL
MMLV Buffer (含dNTP溶液) 5 μL
RNase-Free水 补至19 μL
合计 19 μL
注意:如果可能,最好使用Poly(A) RNA作为模板。
2. 65℃保温 5 分钟, 展开 RNA 的二级结构,立即冰浴待用。
3. 在冰浴的 PCR 管中加入 1 μL MMLV 逆转录酶-RI 混合物。
4. 先 37℃保温 60 分钟,再 42℃保温 30 分钟进行逆转录反应,最后 50℃保温
10 分钟终止反应。
5. 加入 0.5 mL RNase-free 水稀释上步得到的 cDNA,冰浴待用。长期放置需要
放-20℃保存。
三:利用基因专一性引物 A 和 3′ RACE 引物 B 进行第一轮 PCR
6. 用不同量的 RT 反应液(即稀释后的 cDNA 模板)设置 PCR,样品组需要设置
模板用量梯度,单位:μL。
成分 梯度1 梯度2 梯度3 梯度4
稀释后的 cDNA 1 5 10 15
基因专一性引物 A(10 μM) 2.5 2.5 2.5 2.5
3′ RACE 引物 B(10 μM) 2.5 2.5 2.5 2.5
98℃ 5 分变性 RNA-cDNA 杂交链,短暂离心后再加入下列成分
PCR MagicMix 2.0 25 25 25 25
RNase-free 水 19 15 10 5
合计 50 50 50 50
7. 按下列参数进行 cDNA 第二链的合成和 PCR:
第 1 步,cDNA 第二链的合成:52-60℃ 2 分,72℃ 40 分(此步的目地是合
成第二链的 cDNA,复性温度需要根据自备基因专一性引物 A 的 Tm 值决定,
一般可以从 55℃开始)。
第二步 PCR 循环:94℃ 1 分钟,52-60℃ 1 分,72℃ 3 分(此步为 PCR 扩
增,复性温度需要根据自备基因专一性引物 A 的 Tm 值决定,一般可以从 55℃
开始)。
最后延伸:72℃ 15 分
8. 取 5 μL PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳以确认 PCR 扩增产物。若得到目的扩
增产物需要用于后续实验,请于-20℃保存;若没有得到目的扩增产物,可按下
列步骤进行巢式 PCR 反应。
四:利用基因专一性引物 B 和 3′ RACE 引物 C 进行巢式 PCR 反应
9. 将上轮 PCR 产物(4 管)用水稀释约 20 倍(在 50μL PCR 反应液中加入 1mL
超纯水),然后分别作为模板进行巢式 PCR 扩增。PCR 反应设置如下:
成分 1-4管
PCR MagicMix 3.0 各 25 μL
上步得到的PCR反应液(稀释20倍后) 4 种之一 1 μL
基因专一性引物 B(10 μM) 2.5 μL
3′ RACE 引物 C(10 μM) 2.5 μL
超纯水 补至 50 μL
10. PCR 反应。按下列条件进行 PCR:
第 1-30 次循环:94℃ 1 分钟,52-60℃ 1 分,72℃ 3 分(复性温度需要根
据自备基因专一性引物 B 的 Tm 值进行优化,一般可以从 55℃开始)。最后延
伸:72℃ 15 分。
11. 电泳检测。然后根据实验结果进行 DNA 测序或 TA 克隆。
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