实验结果不理想,就是因为你忽视了这一步 ··· ···
优化ELISA的重点之一在于洗涤。洗涤步骤可降低未结合抗体所引起的背景信号,从而增加分析的信噪比。每一步之间的洗涤确保只有特异的结合事件被保留,在最后一步产生信号。而不充分的洗涤会导致差异和高背景,从而带来不理想的结果。
在做ELISA实验时,洗板有两种方法:手工法洗板和洗板机洗板。二者没有本质的差别,只要操作合乎要求,均能得到正确、可靠的结果。
手工洗板人为因素比较大,实验人员必须经验丰富,洗涤次数要足够,冲击力又不要太大,加入的洗液量以刚满反应孔为限,防止孔口内有游离酶未能洗净,同时防止孔与孔之间液体交叉。洗涤结束后扣干亦非常重要,否则易造成假阳性。每次洗完板后,在吸水纸上轻轻拍干,拍板时要垂直,避免交叉感染。用力不能过猛,防止抗原抗体复合物脱离;吸水纸要一次性使用,应使用不易脱落碎屑的吸水纸为宜。酶结合物不耐干燥,特别在较高的温度下更易失活,所以拍干的反应板应尽量缩短在空气中暴露的时间,时间越长,吸光度值越低。
手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种方法:
1.吸干或甩干孔内反应液;
2.用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后,即甩去);
3.浸泡,即将洗涤液注满板孔,放置1~2分钟,间歇摇动,浸泡时间不可随意缩短;
4.吸干孔内液体。吸干应彻底,可用水泵或真空泵抽吸,也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干;
5.重复操作步骤3和4,洗涤3~4次(或按说明规定)。在间接法中如本底较高,可增加洗涤次数或延长浸泡时间。
微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的,非离子型洗涤剂既含疏水基团,也含亲水基团,其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合,从而削弱蛋白质与固相载体的结合,并借助于亲水基团和水分子的结合作用,使蛋白质回复到水溶液状态,从而脱离固相载体。
洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20,其浓度可在0.05%~0.2%之间,高于0.2%时,可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。
流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤,洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置,使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗,持续冲洗2分钟后,吸干液体,再用蒸馏水浸泡2分钟,吸干即可。浸泡式犹如盆浴,流水冲洗式则好比淋浴,其洗涤效果更为彻底,且也简便、快速。
已有实验表明,流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压,让水流冲击板孔表面,洗涤效果更佳。
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