供货周期: | 现货 |
品牌: | 泽叶生物 |
规格: | 50μl/支 |
货号: | ZY1076 |
CAS号: |
BJ5183-AD-1 Electro电转感受态细胞
BJ5183-AD-1 Electroporation-Competent Cell
BJ5183-AD-1 Electro电转感受态细胞产品规格(CAT#:ZY1076)
BJ5183-AD-1 Electroporation-Competent Cell 50μl/支
pCAMBIA2301 (control vector, 10ng/μl): 10μl
保存条件(保质期): -80℃(6个月)
基因型
endA1 sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR (StrR) [pAdEasy-1 (AmpR)]
BJ5183-AD-1 Electro电转感受态细胞产品说明
BJ5183-AD-1是携带了腺病毒质粒pAdeasy-1的BJ5183菌株。BJ5183菌株是一种具有较高重组活力的大肠杆菌菌株,是目前腺病毒系统最常用的感受态细胞。BJ5183菌株含有sbcBC recBC双重突变,赋予BJ5183细胞较强的重组能力,有利于转入的目的基因与腺病毒骨架质粒的重组。endA1(缺失核酸内切酶)的突变有利于重组DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。BJ5183-AD-1菌株细胞中已经提前转入了腺病毒质粒pAdeasy-1[encodes the Adenovirus-5 genome (E1/E3 deleted)],赋予该菌株氨苄抗性,在病毒质粒构建时,只需转入线性化的目的质粒即可,简化了实验步骤,提高了病毒质粒重组概率。StrR 赋予BJ5183-AD-1菌株链霉素抗性。BJ5183-AD-1电击感受态细胞适用于普通质粒和大质粒的构建,经特殊工艺制作,pCAMBIA2301质粒(size:1163bp)检测转化效率>1×106 cfu/μg DNA。
BJ5183-AD-1 Electro电转感受态细胞操作方法
1. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,使乙
醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中
静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的BJ5183-AD-1电击感受态细胞插入冰中5分钟,待其融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。
A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒pCAMBIA2301;
B. 对于连接产物,请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重
悬,DNA浓度不超过100 ng/μl,体积不超过5 μl/50 μl感受态。
3. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中,避免产生气泡,盖上杯盖。
4. 启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数,也可按所用
电转仪推荐的参数操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。
5. 2分钟后从冰中取出电击杯,放室温,加入700 μl不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基(室温),用1ml
枪吹吸电击杯底部数次混匀后,转移到50 ml离心管(BD Falcon 50 ml锥形离心管等),向离心管中
补加S.O.C. 培养基至10 ml。37℃,225 rpm复苏60分钟。
6. 5000 rpm离心一分钟收菌,重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上(因菌量较大,
若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
BJ5183-AD-1 Electro电转感受态细胞注意事项
1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。
2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡,气泡会增加弧光放电风险。
3. 当DNA不纯或存在盐,乙醇,蛋白及缓冲液等污染时,转化效率急剧下降。
4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导,增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率,推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
6. 对于连接产物转化,最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物,保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率,增加弧光放电的风险。
7. 混入质粒时应轻柔操作,吸取感受态细胞时避免用力过猛,以免剪切力过大损伤细胞膜,降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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