供货周期: | 现货 |
品牌: | 泽叶生物 |
规格: | 30次 |
货号: | ZY60606-30 |
CAS号: |
一站式miRNA尿素-PAGE电泳套装
One-Stop miRNA Urea-PAGE Pack
尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Urea PAGE)是目前分离200nt以下的小片段RNA,尤其是20nt左右的microRNA(miRNA)分子的主要方法,但是单独配制各种溶液十分繁琐,为此我们公司开发了本产品。
产品特点:
1.一站式,含有电泳所需要的所有试剂,即开即用,十分方便,免去了实验人员称取有毒物品。
2. 灵活,可以根据需要配制各种浓度的Urea-PAGE,以便对长度各异的RNA进行电泳。
3.电泳后可直接用于UV观察、银染、胶回收、Northern杂交和放射自显影等。
4. 使用新型缓冲液,可以防止甘油的干扰。
产品组成:
储存条件:常温运输、4℃保存(miRNAload、miRNA Marker需要-20℃保存)。保存期为一年。
使用方法:
一、准备工作
1. 用固相RNase清除剂清洁工作的台面和器皿(详见该产品的使用手册)。
2. 配制1 X电泳缓冲液:将适量的10X电泳缓冲液用RNase-free水稀释10倍,得到1X电泳缓冲液待用。
3. 配制10%过硫酸铵溶液:精确称取约100mg过硫酸铵到一干净的1.5mL离心管中,按每1mg过硫酸铵加10μl RNase-free水的比例加入RNase-free水,摇晃致溶,立即使用。注意:放置时间不要超过一周。
二、配制凝胶
1. 估计所需要的凝胶溶液的体积,一般配制一块13cm×15cm×0.8mm的胶需要15mL凝胶溶液,配制一块36cm×45cm×0.8 mm的胶需要120mL凝胶溶液。
2. 根据所需要的凝胶溶液的体积,在一的干净的三角瓶中按下表加入各成分(此处以配制100mL浓度为15%的凝胶为例):
注:Acrylamide/Bis的终浓度需要根据待分离RNA长度选择(见下表)。
3. 搅拌并加热到40-50℃左右,直到尿素完全溶解。
4. 冷却到室温后,将三角瓶接上真空系统抽真空处理10-15分钟以充分去除溶液中的氧气(氧气会降低聚合反应效率)。但如果实验条件有限,此步也可以省略。
5. 边摇晃溶液变加入50μl TEMED和500μl 10%过硫酸铵。注意:即使选择其他工作浓度的Acrylamide/Bis,TEMED和10%过硫酸铵的用量也不需要随之改变。但如果配置的凝胶溶液的体积变化,TEMED和10%过硫酸铵的用量也要按比例改变。
6. 再充分摇晃约30秒后迅速灌胶,然后插入样品梳。
7.室温放置30-60分钟使胶凝固。
8. 将凝胶板放置在电泳装置上后,在上下层分别加入适当量的1×电泳缓冲液。如果不马上使用,需要有湿纸将上样孔端盖住以防凝胶过度干燥。
9. 拔出梳子后用加样枪吸取电泳缓冲液,充分将每个加样空中未聚合的Acrylamide/Bis、尿素和气泡吹打出来。
三、电泳
1.在上样前,预电泳 20-30分钟以使多余的过硫酸铵跑出加样空,同时还可以使凝胶的温度升高(到 50℃左右),有利于RNA电泳时维持在变性状态。预电泳电流见下面第 5 条。
2. 将miRNA样品与等体积的miRNAload 混合,70℃保温 2-3分钟后迅速放置在冰上冷却,快速离心半分钟,放冰上待用。
3. 关电泳仪后开始上样。注意:每次上样后如果不更换枪头,则需要充分吹打洗净枪头以防样品的交叉污染。
4. 同时上样 miRNA Marker。
5. 重开电泳仪,对 13cm×15 cm的胶,以20-30mA的电流电泳,直到红色染料移动到凝胶边缘为止;对 36cm×45cm的胶,则以50-60mA的电流电泳,直到红色染料移动到凝胶边缘为止。
四、后续处理
1.染色观察:将凝胶一面的玻璃板揭开,直接用仍然附着在另一玻璃板上的凝胶进行各种染色,包括银染(固定、漂洗、显影和定影等步骤)、EB(每100mL 1×TBE中加 20μL 10mg/mL的EB溶液)、我们公司低毒核酸染料 DNAgreen(每100mL 1×TBE中加10μL DNAgreen 原液)。UV下观察并拍照。
2. miRNA回收:按上法用EB等染料染色后,UV下确定所需要的miRNA条带的位置,切胶后进行胶回收处理。
3. Northern杂交:按上法用EB等染料染色后,UV下确定所需要的miRNA条带的位置,切胶后电转移到带正电的尼龙膜上,然后进行杂交处理。
4. 放射自显影:如果miRNA样品电泳前经过同位素标记,则将凝胶一面的玻璃板揭开,用滤纸将附着在另一玻璃板上的凝胶吸附过来,然后包上保鲜膜,真空抽干,然后使胶跟X光片向对置进行放射自显影。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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