供货周期: | 现货 |
品牌: | 泽叶生物 |
规格: | 50次 |
货号: | ZY61108-50 |
CAS号: |
T3体外转录试剂盒
T3 in vitro Transcription Kit
本试剂盒是基于沙门氏噬菌体T3 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒,它利用含有T3启动子的模版DNA,以NTP为底物,从T3启动子下游开始合成与模板DNA中一条链互补的RNA,简单快速获得大量的RNA分子。
产品特点:
1. 即开即用,用户只需提供含T3启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验,不需耍单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液,减少加样次数,避免了操作误差,增加了可重复性。
3. 模板DNA可以是线性化的质粒DNA,也可以是PCR扩增产物。
4.可以合成的RNA的最佳长度在20nt到5000nt之问。
5.产品配方经过精心优化,每μg DNA模板可以合成2-6μg RNA。
6. 得到的RNA可以用于RNA结构研究、核解生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和RNA干扰(RNAi)等实验。
试剂盒组成:
储存条件:低温运输,-20℃保存,有效期一年。
使用方法:
一、制备DNA模板
PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板,但是必须注意以下几点:
1)必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA,则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。
2)是需要转录的DNA序列的上游必须有T3启动子。如果模板是PCR产物,则可以在设计引物时将T3启动子序列(5′AATTAACCCTCACTAAAGG 3′)加上。如果是将DNA片段克隆到载体上,则需要选择有T3启动子的载体,并且克隆位点必须位于T3启动子下游。
3)是需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3′突出。如果是3′突出(如选择了Pst I来线性化质粒),则最好用T4 DNA聚合酶修平。
4)是必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A,因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染,所以在用作模板前,最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温,然后电泳检测RNA是否被降解,以此判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。
二、体外转录反应
1.在一个RNase-free的塑料离心管中,在室温下(不是在4℃下)按次序加入下列成分:
注:此为20μL反应体系的用量,对其他体积的反应体系,各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记RNA探针,则需要定做NTP分开而不是NTP预先混合的试剂盒。如果需要得到加帽RNA,则需要加入自备的加帽修饰核苷酸(本公司有各种加帽修饰核苷酸)。
2. 37℃保温1-2小时。注意:延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热10分钟灭活T3 RNA聚合酶。
4. 取1-3μL电泳检测转录效果。一般1μg DNA可以合成 5-10μg的RNA。
5. 得到的RNA可以放-80℃保存。
若需进一步去除DNA模板,可参考下列操作步骤,但所用试剂需另行购买,本试剂盒不提供。
1.在体外转录结束后,在反应体系中加入3-5U自备的RNase-free DNase(BTN90903;3-5U/μL)。
2. 37℃保温15-30分钟。
3. 补水到100μL,
4. 用自备的等体积(100μL)的Tris饱和酚-氯仿抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。
5.在上清中加200μL自备的微量核酸沉淀剂(BTN50903;用前需要摇晃混匀),振荡后15000rpm离心3~5分钟,弃上清。
6. 加入1mL 75%乙醇,震荡10秒后15000rpm离心3~5分钟,弃上清。
7. 短暂离心数秒,用枪头吸弃上清。
8. 晾干半分钟,所得沉淀即去除DNA模板后的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。
疑难解答:
1、没有RNA产物。最常见原因是DNA模板有RNase污染,测试方法是用纯化的RNA跟模板DNA一起保温,再检测RNA是否降解。本试剂盒缓冲液和酶混合液中有RNase inhibitor,如果模板RNase污染严重,可能需要用户补加RNase inhibitor。
2、RNA产量低。最常见的原因是DNA模板序列。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G,在前14个碱基内避免有U存在。
3、RNA长度比预期的短。可能是模板序列中有T3 RNA聚合酶的终止序列。可以改用SP6或T7体外转录试剂盒(启动子也必须改成SP6或T7启动子)。
4、RNA长度比预计的长。T3 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样,有不依赖于模板的加尾功能,最多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多,使用的模板又是质粒DNA,则可能是质粒DNA线性化不彻底。
5、5′单磷酸还是三磷酸。如果使用GTP,则得到的RNA是三磷酸,体外转录时如果保温时间太长(如12小时),则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP,则T3 RNA聚合酶将优先使用GMP,所得RNA产物中5′端是单磷酸的比例将大大增加。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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