供货周期: | 现货 |
品牌: | 泽叶生物 |
规格: | 2 mL |
货号: | ZY600102-2 |
CAS号: |
一站式His标记蛋白质微量纯化套装
One-Stop His-Tagged Protein Miniprep Pack
本试剂盒基于His-Ni亲和层析的蛋白质纯化方法,是目前分离纯化重组表达蛋白质的重要方法,本产品就是专门用于上述实验的一站式产品。
特点:
1. 一站式套装,含所需的介质、溶液和层析柱,用户只需要提供表达His蛋白的细菌(酵母、杆状病毒、培养细胞)即可,非常方便。
2. 专一性强,一次过柱即可获得纯度高达95%的His-标记蛋白。
3. 变性和非变性条件均可使用,也适用于纯化包涵体中的His标记蛋白。
4. 每次可以处理20mL的表达菌液,适合初步筛选和鉴定。
5. 提供4mL浓度为50%的Ni-Agarose介质,其最大载量为20-30 mg His标记蛋白质/mL介质。
6. 介质为CL-6B琼脂糖,含四个Ni离子螯合基团,比只有四个Ni离子螯合基团的Ni-IDA更有效。
7. 本介质可以反复使用多次。
产品组成:
保存条件:常温运输和保存,但介质长期需4℃保存,溶菌酶、Benzonase溶液和PMSF溶液需-20℃保存,有效期一年
自备试剂:去离子水、20%乙醇、0.45μm滤膜
使用方法:
1. 将Ni-Agarose介质充分混匀后,取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中(介质用量需要根据His蛋白产量决定,其最大载量为20-30 mg His标记蛋白质/mL介质,请根据实验需要取适量的Ni-Agarose介质加入层析柱)。
2. 用5倍柱体积(指填料的体积,下同)自备去离子水洗柱,共三次。
3. 用5倍柱体积的新配结合液洗柱(配方如下,以10mL为例),共三次:
4. 室温5000 g离心10分钟收集20mL表达菌液,弃上清,沉淀(约100 mg)放冰上待用或放-80℃保存。最好用不加诱导物的菌液做对照样。
5. 如果超声破碎细菌:加入1mL冰浴的结合液(1mL菌液需要用50μl结合液),再加入25μl PMSF(10 mg/mL)溶液,冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索,但裂解物必须不粘稠,否则会堵塞层析柱。如果酶法裂解细菌:加入1mL冰浴的含溶菌酶的结合液(先取20mL结合液,加入所有30 mg溶菌酶干粉,溶解后分装成1mL/管,剩余的-20℃放置),再加入25μl PMSF(10mg/mL)溶液和1μl Benzonase,冰上放置30分钟。
6. 4℃下13000-15000 g离心10分钟,去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱,收集上清,留样做SDS-PAGE电泳对照。如果要纯化裂解液中可溶部分的His标记蛋白,则直接进入第7步;如果要纯化裂解液中包涵体(沉淀部分)中的His标记蛋白,则直接进入第12步。
A、纯化细胞裂解液中可溶部分的His标记蛋白
7. 将上步得到的上清液上柱,让重力使裂解液自然流出。如要提高His标记蛋白与介质的结合效率,可用试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上,让细菌裂解液和介质在4℃结合30分钟或过夜。
8. 用10倍柱体积结合液洗柱(配方见上表),收集并保存穿透液(含杂质或没被吸附的His标记蛋白,可做SDS-PAGE电泳的对照)。
9. 如果用一步式洗脱法(适合已经找到最佳咪唑浓度的情况),则直接用适量的新鲜配制的洗脱液洗柱,收集并保存穿透液(含His标记蛋白)。洗脱液的配方如下(以1mL体积和最佳咪唑浓度是500 mM为例):
10. 如果用多步式洗脱(适合不知道最佳咪唑浓度或一步式洗脱杂质多的情况),则按上表配制一系列咪唑浓度不同(如40、60、100、200、300和500 mM),其他成分浓度不变的洗液,按从低到高的顺序洗涤并收集样品,SDS-PAGE电泳检测His标记蛋白所在的区域。
11. 洗脱后,依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子,再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没),最后堵住层析柱下端的漏口,4℃保存待下次使用。
B、纯化包涵体中His标记蛋白
12. 将第6步离心得到的包涵体沉淀重悬于1-3mL含盐酸胍结合液中或1-3mL含尿素结合液中(建议优先使用尿素做变性剂,因为得到的洗脱液可以直接跑SDS-PAGE,而用盐酸胍的洗脱液需先除盐后才能电泳)。冰浴1小时以使包涵体溶解,期间可轻柔摇晃几次。含变性剂的结合液配方如下(以10mL为例):
13. 室温10000×g离心20分钟,沉淀为未溶解的包涵体。将上清(含溶解后的His标记蛋白)以自备的0.45 μm滤膜过滤。
14. 将滤过液上柱,后续纯化步骤同第7-第11步。只是所用结合液和洗脱液均含变性剂,含变性剂的洗脱液配方见下表(以1mL为例):
注意事项:
整个实验需避免含巯基乙醇、DTT和EDTA等成分。若洗脱液不能将His标记蛋白洗脱下来,可改用pH 6.5- 4.5的pH递减的Tris-HCl洗脱。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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