供货周期: | 现货 |
品牌: | 泽叶生物 |
规格: | 10次 |
货号: | ZY600811-10 |
CAS号: |
质谱兼容型蛋白银染试剂盒
MS-Compatible Silver Stain for Protein
银染是目前检测PAGE电泳分离后的蛋白质的最灵敏的方法,MS(质谱)是确定未知蛋白最常用和最快捷的方法,但将银染得到的蛋白直接用于MS分析有很多问题,其中最主要问题是常规银染所使用的试剂(包括强氧化剂和醛类)容易使蛋白质发生化学修饰,这样MS分析得到的氨基酸信息跟蛋白质实际的氨基酸信息并不相同。为了使银染得到的蛋白质可以用于MS分析,为此本公司开发MS 兼容型银染试剂盒。
产品特点:
1.跟MS 兼容,原理是避免使用能化学修饰蛋白质的试剂,所得蛋白质没有发生化学修饰,故可直接用于后续的MS(包括MALDI-TOF-MS和ESI-MS)分析。
2.银染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高100倍左右,可达0.2-0.6ng蛋白质/条带。
3.可用于各种PAGE胶,包括变性PAGE胶(如SDS-PAGE,尿素-PAGE),非变性PAGE胶,IEF胶(等电电泳胶),2D胶等。
4.四种溶液都是现用现配,实验结果的可重复性好。
产品组成:
储存条件:常温运输及保存,有效期一年。
准备工作:
所有溶液均需现配现用。以下按一块PAGE胶需要200mL溶液配制,用户可以根据自己PAGE胶的大小增减溶液的用量。
一、用自备试剂配制400mL固定液(按一次银染需要固定2次计算,每次固定需200mL固定液)
将160mL甲醇、40mL乙酸和200mL去离子水充分混合后即得400mL固定液。
二、配制200mL溶液A
先配制溶液A组分一储备液:将溶液A组分一干粉加入到100mL溶液A组分一溶剂中,充分摇晃溶解即得溶液A组分一储备液。此溶液可以4℃保存。将60mL甲醇、8mL溶液A组分一储备液、1 份溶液A组分二(干粉)和132mL 去离子水充分混合后即得200mL溶液A。
三、配制200mL溶液B
称0.5g溶液B干粉,溶于200mL 去离子水中,充分混合后即得200mL溶液B。
四、配制200mL溶液C
将1 份溶液C(干粉)溶解在200mL 去离子水中(干粉不容易溶解,需搅拌)即得溶液C。注意:使用前还需要再加入160μL溶液C组分二并充分混匀。
五、配制200mL溶液D
将1 份溶液D(干粉)溶解在200mL 去离子水中即得溶液D。
银染:
1.PAGE电泳(包括非变性PAGE,SDS-PAGE,尿素-PAGE,2D-PAGE,IEF-PAGE等)结束后,将PAGE胶转移到装有200mL 固定液的瓷盘或玻璃盘中,摇晃30分钟以去除干扰银染的组分(如甘氨酸、SDS、尿素、DTT、甘油等),倒掉固定液。注:此步很重要,否则银染背景很高。
2.重复上步一次。
3.将PAGE胶转移到200mL溶液A中,室温摇晃30分钟。
4.用200mL 去离子水漂洗3次,每次5分钟(不要延长或缩短)。
5.将PAGE胶转移到200mL的溶液B中,室温摇晃20分钟。
6.用200mL 去离子水漂洗2次,每次1分钟(不要延长或缩短)。
7.将PAGE胶转移到200mL的溶液C中,室温摇晃直到蛋白电泳条带显现(一般需要10分钟左右)。
8.将PAGE胶转移到200mL的溶液D中,室温摇晃终止反应。
9.用200mL 去离子水漂洗3次,每次5分钟(不要延长或缩短)。
10.切下条带或胶块进行后续的脱银,原位trypsin酶解,多肽沉淀和MS分析(略)。
技术资料:
MS前处理步骤(仅供参考)
1.脱银:将切下的银染斑点或条带用脱银液(30mM K3Fe(CN)3和100mM Na2S2O3的1:1的混合液)处理直到黑色消失。
2.还原:将胶块或胶条置于10mM DTT(溶剂为50mM NH4HCO3),56℃处理一小时。
3.烷化:将胶块或胶条置于55mM 碘乙酰胺(溶剂为50mM NH4HCO3),室温避光处理45分钟。
4.原位trypsin酶解:将胶块或胶条置于10 ng/uL 测序级别的trypsin溶液中(溶剂为25mM NH4HCO3),37℃处理过夜。
5.多肽提取:用5%三氟乙酸抽提酶解液,再用2.5%三氟乙酸-50%ACN 混合液抽提酶解液,上清真空干燥,沉淀(多肽)最后溶于0.5%三氟乙酸中。
6.MS分析:参考相关MS仪器使用手册。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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