供货周期: | 现货 |
品牌: | 泽叶生物 |
规格: | 5次 |
货号: | ZY611208-5 |
CAS号: |
植物线粒体纯化试剂盒
Plant Mitochondria Purification Kit
植物线粒体是重要的植物细胞器,负责ATP的产生。此外植物很多重要的特性(如雄性不育)也跟线粒体相关,是母系遗传研究的重要材料。对植物线粒体进行生化和遗传研究都需要进行线粒体纯化。本产品就是专门用于植物细胞线粒体纯化的试剂盒。
产品特点:
1. 即用型试剂盒,用户不需要单独配制各种溶液。
2. 提供粗提和精提两种操作方案,粗提利用常规台式冷冻离心机的差速分离原理进行线粒体粗提,所得线粒体含少量其他细胞器污染,可用于后续的SDS-PAGE,Western,ELSIA和蛋白组分析,也可以用于PCR 级别的线粒体DNA和RNA提取。
3. 精提利用冷冻超速离心(离心力达40000g)制备的密度梯度来将粗提制备的线粒体和其他细胞成分进一步分开,得到线粒体精提液,适用于后续的偶联分析、体外线粒体蛋白合成、线粒体成份定位等精细实验。也可用于后续的SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白组分析和测序级别的线粒体DNA和RNA提取。
4. 本产品足够5 次提取,每次可处理10g 绿色植物组织(可得1-2.5 mg左右线粒体)或20g非绿色植物组织(可得2-5 mg左右的线粒体)。
产品组成:
保存条件:常温,有效期一年。
自备试剂:超纯水,可能需要5MKOH调pH,如果需要去除细胞核DNA,还需要自备25mMMgCl2溶液、0.5MEDTA溶液、DNase干粉和另购更多洗涤液。
使用方法:
注意:线粒体膜对温度高度敏感,所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行,所用植物组织,器皿和溶液均需要在4℃预冷。任何情况下线粒体的温度都不要超过4℃。
一:选择组织
1. 植物组织不同,线粒体产率不同,请以下表为参考:
2. 一般纯化最好选用用黄化苗。如果用绿色组织(如叶片),需将植物提前放在暗室至少3 天以降低淀粉含量,否则淀粉颗粒将干扰线粒体的纯化。
3. 一次实验需要40mL 匀浆液、约90mL 洗涤液和35mL 密度梯度离心介质(配制方式是一次性将9.8g (8.7mL) Percoll 加入到26.3mL 离心介质溶液中,充分混匀后得到35mL 密度梯度离心介质)。这三种溶液用前均需要加入BSA 干粉使其终浓度为0.1%(100mL 溶液加0.1g BSA 干粉,轻柔颠倒混匀或搅拌溶解后放冰上预冷待用)。每次实验用多少配多少,不要预先将所有BSA 干粉加入,否则容易长菌。
二:线粒体粗提操作流程
1. 将10 g的绿色植物组织(如去叶脉后的嫩叶子,愈伤组织)或20 g 干净的非绿色植物组织(如发芽组织、根、块茎等)浸泡在冰水中10分钟,用纸吸干液体后浸泡在预冷的40mL 匀浆液(需先加0.1% BSA)中,在浸泡状态下剪成1cm2大小的碎片。注意:如果样品可分成多组平行处理,得到线粒体粗提物后再汇集,否则线粒体产率将急剧降低。
2. 将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到Waring 匀浆器中,中速匀浆3 次,每次15 秒,每次之间间隔10 秒以便让碎片沉淀下来到刀片处。也可使用研磨法。具体操作是将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到预冷的研钵中,研磨3-4分钟。
? 注意:植物组织匀浆后释放的物质会使匀浆液酸化,降低pH,而线粒体对pH变化非常敏感,因此建议匀浆后用pH 试纸检测匀浆液的pH,如果低于7.0,必须用自备的5 M KOH 将pH 调到7.0 以上才进入下一步。
3. 用带柄尼龙筛过滤匀浆液,穿透液可通过预冷的漏斗收集到预冷的50mL的塑料离心管中。带柄尼龙筛可以洗干净后可以反复使用。
4. 在低速固定角度冷冻离心机上4℃ 1000 g 离心5分钟,沉淀为未破碎的细胞、破碎细胞的碎片、细胞核和淀粉颗粒,上清含线粒体。小心转移上清到新的预冷的50mL 塑料离心管中。
5. 将装上清的离心管在水平冷冻离心机上4℃ 12,000 g 离心20分钟,弃上清液,所得棕绿色沉淀即为纯化的线粒体粗提物。有时沉淀底部还有白色的淀粉沉淀,属于正常现象。
6. 加入10mL 预冷的洗涤液(需先加0.1% BSA,下同)中,用软毛笔轻柔重悬线粒体沉淀(如果最底下有白色淀粉沉淀,需要避免重悬之)。不能剧烈震荡,否则线粒体容易破裂。
7. 将线粒体重悬液转移到新的50mL 离心管中,再加入30mL 预冷的洗涤液(终体积为40mL)中,4℃ 1000 g 离心5分钟。线粒体将在上清中。
8. 将上清转移到新的预冷的50mL 离心管中,4℃ 12000 g 离心20分钟,沉淀为线粒体。小心弃上清。到此步时,线粒体回收率一般在15-30%。
9. 在沉淀中加入2mL 预冷的洗涤液。用软毛笔轻柔重悬,得到线粒体粗提液。如果有平行提取,可将最多4 管线粒体沉淀重悬在2mL 洗涤液中。线粒体粗提液中线粒体的回收率一般在45-75%。
10. 所得线粒体粗提液含其他细胞器(如类囊体膜, 质体, 过氧化物酶体, 乙醛酸循环体,或细菌)污染,但可直接用于PCR 级线粒体DNA和RNA的提取、呼吸链功能测定、蛋白浓度测定和线粒体精提。如果需要长期保存,则可以在线粒体重悬液中加入1/20 体积的自备DMSO,混匀后分成0.5mL/管,然后放-80℃保存。如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。
三:细胞核DNA的去除(纯化测序级的线粒体DNA 才需要进行此操作。本产品不提供相关试剂,实验步骤仅供参考)
11. 预留50uL 线粒体粗提液做对照,在约2mL 剩余的线粒体粗提液中加入40μl25mM的MgCl2,再加入200ug DNase 干粉或溶液(总量为200ug 即可),混匀后冰上放置60分钟降解DNA。取少量样品(如50uL)在PCR 仪器中加热到95℃变性10分钟灭活DNase,再取其中的10uL和10uL 预留的样品一起进行细胞核基因专一性PCR,如果DNase 处理的样品没有扩增,而预留样品有扩增,则表明DNA 去除比较干净(达到PCR 检测的极限),则进入下一步。如果未去除干净,则继续在冰上放置,直到PCR 检测不到细胞核DNA。
12. 加入0.32mL 预冷的自备0.5M的EDTA 溶液和40mL 预冷的洗涤液。
13. 4℃ 1000 g 离心5分钟,将上清转移到新的预冷的50mL 离心管中,4℃ 12000g 离心20分钟,沉淀为去除细胞核DNA的线粒体。重悬在2mL 洗涤液中。
四:线粒体精提操作方案(需要40000g的超速冷冻离心机)
14. 在50mL 预冷的塑料离心管中先后加入35mL 预冷的密度梯度离心介质(配制方法见第三步,用前需先加0.1% BSA)。
15. 将2mL 线粒体粗提物重悬液铺在密度梯度离心介质上。
16. 在超速水平离心机上4℃ 40,000 g 离心45分钟,最上层为黄色或橙色的质体带(如果材料是绿色植物,此带将是绿色),其下的白色不透明的带即为线粒体,管底沉淀为过氧化物酶体。其示意图如下:
17. 用广口吸管(可将1mL 蓝抢头中间剪断后使用)收集线粒体带,注意避开其上的质体带过氧化物酶体沉淀,估计所取含线粒体溶液的体积。
18. 在15-20分钟的时间内缓慢加入至少4 倍体积的预冷的洗涤液。
19. 转入50mL 塑料管离心管中,在冷冻离心机上4℃ 15,000 g 离心20分钟,沉淀为线粒体。
20. 将线粒体沉淀用软毛笔小心重悬在至少4 倍体积的预冷的洗涤液中,在冷冻离心机上4℃ 15,000 g 离心20分钟,弃上清,沉淀即为洗涤后的线粒体精提物。到此步时,线粒体回收率一般在5-15%。
21. 将精提的线粒体重悬在1mL 预冷的洗涤液中。重悬的线粒体可以立即使用,在冰上最多可放置5-6 小时。如果需要长期保存,则可以在线粒体重悬液中加入1/20 体积的DMSO,混匀后分成0.5mL/管,然后放-80℃保存。如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。
五:线粒体后续处理(本产品不提供相关试剂,实验步骤仅供参考)
22. DNA 提取:离心得线粒体沉淀,再按常规的SDS-蛋白酶K 酶解,酚氯仿抽提,乙醇-盐沉淀的方法制备线粒体DNA。也可以用细菌DNA 提取的试剂盒制备DNA。
23. RNA 提取:离心得线粒体沉淀,再按常规的Trizol 方法制备线粒体RNA。
24. 总蛋白提取:按细菌总蛋白提取方法。
25. 线粒体内膜,外膜、基质纯化:请自备方法。
26. 其他功能检测:请自备方法。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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