供货周期: | 现货 |
品牌: | 泽叶生物 |
规格: | 50次 |
货号: | ZY611009-50 |
CAS号: |
端粒重复片段扩增(TRAP)试剂盒
TRAP Kit
产品及特点 端粒酶存在于 85-90%的肿瘤组织中,因此通过检测端粒酶活性就能早期诊断大多
数肿瘤。目前最常用的检测端粒酶活性的方法就是 TRAP (telomeric repeatamplification protocol,端粒重复片段扩增),它利用端粒酶能在底物 DNA 末端添加不同数量的 TTAGGG 序列这一特点,通过 PCR 检测延伸产物而高效检测端粒酶活性。本产品专门用于快速测定人类细胞端粒酶活性。它具有以下特征:
1. 一站式,提供从细胞裂解到 PCR 的所有试剂,但不含 PAGE 和银染试剂。
2. 一管式操作,端粒酶延伸和 PCR 在同一体系中完成,方便快捷。
3. 提供改进的、长为 150 bp 的内参和含 8 个端粒序列的合成端粒,可有效排除 PCR假阴性。内参长度远大于 TRAP 产物,不会干扰结果分析。
4. 改良的 TS 模板和 PCR 引物,极大降低了引物二聚体的形成。
5. 既可用于培养细胞,也可用于实体组织。
6. 灵敏度高,最低可以检测到 10 个肿瘤细胞中的端粒酶活性
运输及保存 低温运输,-20℃保存,有效期一年。
自备试剂 PAGE 电泳及银染试剂盒
使用方法 一:端粒酶的提取
注意:端粒酶的组成成分中有 RNA,极容易被降解,因此,应该跟提取 RNA 一样,尽量在低温条件下快速操作、最好使用固相 RNase 清除剂(CAT#:3090)清洁试验台。
1. 对冷冻的实体组织:将50-100 mg冷冻组织在液氮中用预冷的研磨器研磨成粉末,再转移到预冷的玻璃匀浆器中,加入 200 uL 预冷的 TRAP 细胞裂解液,温和手动匀浆数次后冰浴 30 分钟,每间隔数分钟涡旋振荡一次,共 5-6 次,然后直接进入第 3 步操作。为保证裂解效果,可在显微镜下观察。如果组织样品不足 50-100mg,可以按比例降低 TRAP 细胞裂解液的用量。
2. 对新鲜的培养细胞和组织:用自备的预冷 PBS 洗涤 105-106个经过胰酶处理的细
胞或 50-100 mg 新鲜组织,3000 g 4℃离心 5 分钟,弃上清;加入 200 μL 预冷的 TRAP 细胞裂解液悬浮细胞或组织。对细胞:涡旋振荡 10 秒后置冰浴 30 分钟,每间隔数分钟涡旋振荡一次,共 5-6 次。对组织:在冰上用玻璃匀浆器轻柔匀浆后冰浴 30 分钟,每间隔数分钟涡旋振荡一次,共 5-6 次。如果细胞不足 1×106或 50-100 mg,可按比例降低 TRAP 裂解液的用量。
3. 12000-14000 g 4℃离心 20 分钟。
4. 收集 160 uL 上清,先取部分用于测定蛋白质浓度,可通过测定 A215 和 A225得到,计算公式是蛋白质浓度(ug/uL)=0.144×(A215-A225)×稀释倍数,也可使用 BCA 法测定蛋白浓度。本试剂盒制备的细胞裂解物的蛋白浓度一般在10-750 ng/uL。知道各样品的蛋白浓度后,可用 TRAP 细胞裂解液将各样品的蛋白浓度调成一样,然后按 10 μL/管(至少可分 15 管),放-80℃冷冻保存(可存放一年)。每个样品可取一管进行热灭活(95℃处理 10 分钟)后再放-80℃冷冻保存,此管将作为该样品的样品对照。如有必要,可以根据起始细胞或实体组织用
量和最终蛋白量计算出每 ug 蛋白所对应的细胞数或实体组织 mg 数。
二:TRAP 反应
5. 确定每个样品的用量:可以按每个反应加入相同的细胞裂解物 ug 数或其所对应的细胞数或实体组织 mg 数来设置 TRAP 反应,为便于分析比较,每个 TRAP 反应所用的蛋白量(或细胞数)必须一样。由于裂解物中一般都有高浓度的不明 TaqDNA 聚合酶抑制物(TRAP 失败最常见的原因),因此最佳结果往往是在稀释10-1000 倍后得到。如果需要稀释,每个样品的稀释度也需要保持一致。
6. 在 PCR 管中按下表设置 TRAP 反应(50 uL 反应体系,以 A 和 B 两个样品为例。
A 阴性对照和 B 阴性对照分别是 A 和 B 样品的热灭活产物):
成份 A 样品管A 阴性对照管B 样品管B 阴性对照管实验阴性对照实验阳性对照
A 样品 2 uL - - - - -
A 阴性对照 - 2 uL - - - -
B 样品 - - 2 uL - - -
B 阴性对照 - - - 2 uL - -
TRAP
细胞裂解液 - - - - 2 uL -
合成端粒 - - - - - 2 uL
TS 引物
混合物 6 uL 6 uL 6 uL 6 uL 6 uL 6 uL
PCR Mix 25 uL 25 uL 25 uL 25 uL 25 uL 25 uL
超纯水 17 uL 17 uL 17 uL 17 uL 17 uL 17 uL
注:为避免污染,最好等其他样品加完并盖上 PCR 管盖后再加阳性对照(合成端粒)。
7. 吹打混匀后进行 PCR 扩增,扩增条件(仅供参考,用户可优化)如下:
步骤 温度 时间
端粒酶延伸 30℃ 30 分钟
端粒酶灭活 95℃ 5 分钟
PCR
(循环 35 次)
94℃ 30 秒
55℃ 60 秒
72℃ 30 秒
三:PAGE-银染检测及结果解读(本试剂盒不含 PAGE-银染检测试剂盒)
8. 取 5uL PCR 反应液进行 10%非变性 PAGE 电泳-银染显色实验(需另购试剂盒)。如果背景高(主要是由反应体系中的蛋白成分引起),可以 PCR 产物纯化再进行PAGE 电泳和银染。
9. 跟预期结果(见下表)比较。如果结果跟下表不一致,则需要按具体情况分析原因。
成份 样品管结果
样品阴性对照实验阴性对照结果实验阳性对照结果
典型 TRAP 条带(条带数不限)
有则有端粒酶活性无则无端粒酶活性 不出现 不出现 不出现
阳性对照的 TRAP条带(仅 8 条带) 不出现 不出现 不出现 出现
150bp 内参 可出现可不出现 出现 出现 出现
注:本试剂盒所用引物产生的典型 TRAP 条带最小条带为 59bp。当样品端粒活性太强,其端粒产物在扩增时会与 150bp 内参竞争引物,故可能不会出现 150bp 条带。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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