供货周期: | 现货 |
品牌: | 泽叶生物 |
规格: | 150次 |
货号: | ZY630301-150 |
CAS号: |
DNA甲基化修饰试剂盒
Embedded Bisulfite Modification Kit
亚硫酸氢盐修饰DNA时要求DNA必须在单链状态,反应还必须在低温进行,常规的修饰试剂盒由于是在液相进行,要在低温下让DNA不相互复性而保持单链状态非常棘手,所以常规修饰试剂盒的修饰效率一般都不高。此外,常规方法要切换反应液,有多次沉淀步骤,使得DNA的回收率一般都不超过50%。为克服这些缺点,本公司开发出了此升级产品。
产品特点:
1.用包埋的样品进行所有操作,免去所有沉淀和纯化步骤,极大简化了操作。
2.免去了DNA提取过程,所需实验材料比常规方法更少,最少几个细胞都可以,极大地节约了宝贵材料,尤其适用于珍稀材料。
3.包埋处理后,DNA在整个操作过程中都处于最适于修饰的单链状态,极大提高了修饰效率。
4.DNA包埋于包埋块中,切换反应液非常方便,而且DNA不会丢失,所以最终回收率都在90%以上。
5.适用于实体材料、悬浮细胞和纯化好的DNA样品。
6.本试剂盒足够制备150多个10μL包埋块(如果用纯化好的DNA)或25个10μL包埋块(如果用悬浮细胞)。
试剂盒组成:
注: 包埋液用1.5mL旋盖离心管包装,溶液B成分一用5mL棕色瓶包装,溶液B成分二用1.5mL旋盖棕色管包装。
储存条件:低温运输、4℃保存、避免反复冻融,有效期一年。
使用方法:
一、准备试剂
1.在装有2.3g溶液B成分一干粉的瓶中加入3.9mL水和0.9mL溶液A,摇晃溶解得到4.8mL溶液B成分一。在装有110mg溶液B成分二干粉的离心管中加入1mL 50℃预热的超纯水,摇晃溶解,得到溶液B成分二。将0.6mL溶液B成分二加入到4.8mL溶液B成分一中,得到5.4mL溶液B,冰上放置待用。未用完的溶液B下次不得再使用。
2.每次实验前,将装有1.5mL包埋液离心管在沸水浴上放置数分钟直到变成溶液,然后放80℃待用。
二、对微量组织材料(如果材料足够,可先纯化DNA,再按第三方案进行)
1.用常规的胰酶消化法处理动物实体组织或培养细胞,得到浓度不超过60细胞/μL的单细胞PBS悬液。如果实验材料已经是单细胞悬浮液(如卵细胞),则PBS洗涤后直接离心沉淀,再重悬在PBS中(浓度不超过60细胞/μL)。注:本试剂盒不含本步所需相关试剂。
2.在一个2mL离心管中加入3μL细胞悬液,再迅速滴加7μL在 80℃预热的包埋液。注:不需要吹打混匀以免混合液在抢头里面凝固。
3.加入500μL分子生物学级石蜡油,将离心管在沸冰浴中放置20分钟。
4.将离心管转移到冰上放置30分钟,低温下包埋液和细胞混合液将凝固成10μL的包埋块。
5.加入500μL包埋块裂解液和5μL Proteinase K溶液,37℃保温过夜。加入的溶液比重都比石蜡油大,将会自动沉降到石蜡油下层,不需离心。
6.吸弃包埋块之外的所有溶液(包括石蜡油),用1mL TE缓冲液室温浸泡包埋块2次,每次15分钟。此步可去除残留包埋块裂解液。
7.酶切包埋块中的DNA:选定不识别PCR靶片段的内切酶(本试剂不提供该相关试剂),再用100μL选定内切酶的1×缓冲室温液浸泡包埋块15分钟,吸弃缓冲液后再加入100μL选定内切酶的1×缓冲液和50U选定的内切酶,37℃保温2小时。
8.吸弃酶切反应液,再加入500μL新鲜配制的处理液A(配制方法:100μL溶液A+400μL超纯水)室温放置15分钟,重复此步一次。此时DNA将呈单链。
9.吸弃处理液A后,用1mL新鲜配制的处理液B(注:不是溶液B,配制方法:50μL溶液A+950μL超纯水)室温浸泡包埋块5分钟。
10.吸弃处理液B,加入750μL石蜡油,然后沸水浴20-30秒,使DNA单链彻底彼此分开。
11.奖离心管转移到冰上放置30分钟使包埋块重新凝固。
12.在离心管中加入1mL预冷的溶液B,溶液B将自动沉降到石蜡油下层。继续在冰上放置30分钟。此步用于修饰单链的DNA。
13.将离心管转移到50℃放置3.5小时。
14.吸弃溶液B,用1mL TE缓冲液常温洗涤包埋块2次,每次15分钟。
15.吸弃TE缓冲液,用500μL新鲜配制的处理液C(50μL溶液A+450μL超纯水)常温洗涤包埋块2次,每次15分钟。
16.吸弃处理液C,用1mL TE缓冲液常温洗涤包埋块3次,每次10分钟.
17.吸弃TE缓冲液,所得包埋块可以在4℃保存数月待用,也可以用超纯水洗涤两次(每次15分钟)后直接用做100μL体系甲基化PCR的模板。
三、对纯化好的DNA
18.选用不识别PCR靶片段的合适内切酶酶切纯化的基因组DNA(本试剂不提供所需试剂),总体积不超过20μL,基因组DNA不超过700 ng。
19.酶切结束后,沸水浴5-10分钟灭活内切酶并变性DNA。
20.冰上放置并短暂离心数秒后,再加入4μL溶液A,50℃保温15分钟。
21.迅速加入50μL在80℃预热的包埋液,用手指快速弹击管底混匀溶液并继续放80℃待用。不要吹打混匀以避免包埋液在移液枪头中凝固。
22.在一个新的2mL离心管中,加入1mL预冷的溶液B,再加上750μL石蜡油,并将离心管放冰上预冷。
23.迅速取80℃保温的混合液10μL,用在空中滴加的方式加到上步准备的预冷的离心管中,滴加的混合液遇冷将迅速在石蜡油中形成包埋块并自动沉入管底,得到1个包埋块。注意:不要将枪头浸入到预冷的溶液中,否则包埋液将迅速在枪头内凝固。如果包埋块没有沉到管底,可以用枪头将其拨到石蜡层下面的液相中。
24.再重复上步操作6次(步骤23),共可以得到7个包埋块(约含100ng DNA)。
25.将离心管(含7个包埋块)继续放冰上30分钟进行修饰。
26.后续操作同第13-17步。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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