供货周期: | 现货 |
品牌: | 泽叶生物 |
规格: | 10次 |
货号: | ZY601104-10 |
CAS号: |
3’RACE试剂盒
3′-RACE Kit
研究真核基因的最基础的工作之一就是确定其转录终止位点,目前最通用的方法是3′-RACE法,RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是Frohman发明的、通过PCR快速克隆cDNA末端的技术,它在不建立cDNA文库的前提下,利用已知cDNA序列设计引物,通过往两端延伸和扩增获得其3′-端序列。本试剂盒就是根据3′-RACE原理而开发。RACE的原理如下图:
产品特点:
1. 即开即用,客户不需要单独准备各种材料。
2.反应条件经过精心优化,包括使用无RNase H活性的MMLV和优化的引物。
试剂盒组成:
储存条件:低温运输、-20℃保存、有效期一年。
使用方法:
一、利用含Oligo(dT)的3′-RACE引物A进行逆转录
?注意:MMLV酶使用前必须短暂离心,因为它含50%甘油,及其粘稠,否则将取不到所需体积。
1.在一个PCR管中,加入以下组分:
?注意:如果可能,最好使用Poly(A)RNA作为模板。
??65℃保温5分钟,展开RNA的二级结构,立即冰浴待用。
2. 再在上述PCR管中加入1μl MMLV逆转录酶-RI混合物(200U/μL)。
3. 37℃保温60分钟,42℃保温30分钟进行逆转录反应;然后50℃保温10分钟终止反应。
4. 加入0.5mL RNase-free水稀释上步得到的cDNA,冰浴待用。长期放置需要放-20℃保存。
二、利用基因专一性引物A和3′RACE引物B进行第一轮PCR
5. 用不同量的RT反应液(稀释后的cDNA)设置PCR(样品组最好设置用量梯度,单位:μL)。
6. 按下列条件进行PCR(注:应根据实际情况选择适当的退火温度)。
?第1次循环:52-60℃ 2分,72℃ 40分(此步的目地是合成第二链的cDNA,复性温度需要根据自备基因专一性引物A的Tm值进行优化,一般可以从55℃开始)。
?第2-30次循环:94℃ 1分钟,52-60℃ 1分,72℃ 3分(此步为PCR扩增,复性温度需要根据自备基因专一性引物A的Tm值进行优化,一般可以从55℃开始)。
?最后延伸:72℃ 15分
7. 取5μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳以确认PCR扩增产物。若得到目的扩增产物需要用于后续实验,请于-20℃保存;若没有得到目的扩增产物,可按下列步骤进行巢式PCR反应。
三、利用基因专一性引物B和3′RACE引物C进行巢式PCR反应
8. 将上轮PCR产物(4管)均用水稀释稀释20倍,然后每管均用巢式PCR进行扩增。巢式PCR反应设置如下:
9. PCR反应。按下列条件进行PCR:
第1-30次循环:94℃ 1分钟,52-60℃ 1分,72℃ 3分(复性温度需要根据自备基因专一性引物B的Tm值进行优化,一般可以从55℃开始)最后延伸:72℃ 15分
10.电泳检测。然后根据实验结果进行DNA测序或TA克隆。
注意事项:
1. 如果两轮PCR得到的非特异产物多,可以在RT反应是继续降低3′-RACE引物A的用量。
2.自备的基因专一性引物的GC含量最好跟3′-RACE引物B和引物C的一致,后者长度均为18nt,均含11个G(或C),7个A(或T)。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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