蛋白酶抑制剂混合物片剂（含EDTA）

蛋白酶抑制剂混合物片剂（含EDTA）

凋亡检测流式操作参考方法:

流式细胞仪分析：

制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：

1)        没有染色的细胞;

2)        仅用Annexin V-FITC染色的细胞;

3)        仅用PI染色的细胞.

经处理过的细胞此时可以在流式细胞仪上分析。按照常规的流式凋亡检测的操作即可。

使用流式细胞仪正确分析Annexin V-FITC/PI双染的细胞前要求仪器的荧光补偿来去除两种染料激发光之间的叠加。因为荧光补偿设置与PMT的电压直接相关，所以不同仪器之间的补偿不同。建议在实验开始阶段分析经Annexin V、PI分别单染的细胞来调整荧光补偿去除光谱重叠。根据未处理细胞空白对照和经Annexin V、PI分别细胞染色后的单染对照的分析设定十字门的位置。

Annexin V-FITC的绿色荧光通过FL1通道检测；PI红色荧光通过FL2或FL3通道检测，建议使用FL3。

CCK8和MTT试剂盒性能对照表:

组织单细胞悬液制备方法:

一、酶消化法

酶的作用原理主要有三方面：一是破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等，二是水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质，三是水解组织粘多糖物质。酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类有：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、弹性蛋白酶等。可根据分散的组织类型确定使用的酶类。需要注意的是使用条件和影响因素（酶浓度、酶效价、作用时间、pH值）等，如胃蛋白酶在碱性环境下失去活性，胰酶在中性溶液中活性欠佳。

酶消化法常规程序如下：

1、将适合于酶消化的组织置于离心管中。

2、将选好的酶溶液1～2ml加入盛有被消化组织的试管中。

3、常规消化20～30min（恒温37℃或室温），消化期间间断振荡或吹打。

4、终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞，以低速离心除去细胞碎片。

5、加入PBS 2ml充分混匀，离心弃掉上清。再加入0.5ml PBS重悬细胞。

6、将制备好的单细胞悬液进行荧光标记后上机检测或保存备用。

二、机械法

机械法分散实体组织包括：用剪刀剪碎组织或用锋利的解剖刀剁碎组织，用匀浆器匀浆，用线注射针头反复抽吸细胞等，最后用300目尼龙网过滤细胞得到单细胞悬液。

1、剪碎法

（1）将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水。

（2）用剪刀将组织剪至匀浆状。

（3）加入10ml生理盐水。

（4）用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管内。

（5）离心沉淀1000rpm/min，4～5min，再用生理盐水洗3次，每次以短时低速（500～800rpm/min）离心沉淀去除细胞碎片。

（6）以300目尼龙网过滤去除细胞。

（7）选择适当的固定液（70％冰乙醇等）固定细胞或低温保存备用。

2、网搓法

（1）将100目、300目尼龙网扎在小烧杯上。

（2）把剪碎的组织放在网上，用眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直到将组织搓完。

（3）收集细胞悬液，离心沉淀细胞500～800rpm/min，2分钟。

（4）固定细胞或低温保存备用。

3、研磨法

（1）先将组织剪碎成1～2mm3小块。

（2）放入组织研磨器中加入1～2ml生理盐水。

（3）转动研棒，研至匀浆。

（4）加入10ml生理盐水，冲洗研磨器。

（5）收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀细胞，500～800rpm/min，2分钟，再用生理盐水洗3遍，离心沉淀。

（6）固定或低温保存细胞，备用。

三、化学处理法

化学处理法的主要原理是：将组织细胞间起粘连作用的钙、镁离子置换出来，从而使细胞分散下来。

1、试剂配制

（1）0.2％EDTA配制：将0.2gEDTA溶解于100ml Hank液中，封装高压消毒，置0～4℃保存。

（2）胰酶加EDTA配制：胰酶0.25g加PBS（pH7.0）200ml，浓度为0.125％，EDTA0.2g加PBS（pH7.0）100ml，浓度为0.2％。各取40ml混合，分装后置0～4℃冰箱保存，使用前过滤即可使用。

2、实验方法

（1）将组织切成薄片，置于试管。

（2）首先加入EDTA液5ml，室温下0.5小时，离心弃之。

（3）加入胰酶－EDTA液5～10ml，置37℃恒温水浴30min，间断振荡3～5次。

（4）用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000rpm/min，5分钟。再以生理盐水洗2～3次，离心500～800rpm，1～2分钟。

（5）将细胞固定或低温保存备用。

化学处理法获得的细胞存活率低，细胞产量较低，细胞碎片和细胞聚集量不稳定。

特别提示：本公司的所有产品仅用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！