PikoGreen dsDNA quantitation reagent(优于PicoGreen)

PikoGreen dsDNA quantitation reagent(优于PicoGreen)

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产品描述

PikoGreen是一种极为灵敏的双链DNA荧光染料，仅与DNA双链结合后才发出荧光，且所产生的荧光与DNA浓度呈正比，在存在ssDNA、RNA和单体核苷酸的条件下，可以选择性地检测低至25 pg/mL的dsDNA。与传统DNA定量方法相比，具有灵敏度高，特异性强，耐受性好，线性范围宽及方便操作等优点，适用于cDNA文库构建、DNA亚克隆、PCR产物等领域的DNA浓度的精确测定。相比传统的方法，Pikogreen dsDNA Quantitation Reagent定量具有以下优势：

1. 灵敏：数量级较UV吸光读数更敏感，可节省样品。

2. 特异性强：只结合dsDNA，特异性强，不受样品常规污染影响。传统紫外吸光法容易受样品中存在的单链DNA，蛋白，RNA等影响。

3. 耐受性好：耐受较高浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白或琼脂糖，可以直接定量PCR扩增产物而无需从反应混合物中纯化DNA。

4. 线性范围宽：PikoGreen dsDNA染料测定DNA浓度，在100pg/ml-100ng/ml范围内呈良好线性；荧光计兼容。

5. 容易使用：在样品中加入染料，等待5~6 min染色，然后读数即可，且适用于96和384孔板。与大多数基于荧光的酶标仪和可适用于各种DNA样品分析、PCR的分析、芯片样品、DNA损伤分析、酶活性分析、基因组DNA定量以及复杂混合物中dsDNA的检测和病毒DNA定量等多种领域。

该分析在四个数量级范围内呈线性，且几乎无序列依赖性，可以精确地测量多个来源的DNA，包括基因组DNA、病毒DNA、小量提取DNA或PCR扩增产物。该方法因其稳定性、灵敏性，已经录入《中国药典》。

保存方法

保存放置-20℃避光，保质期为到货后6个月。

使用方法

1. PikoGreen工作液的配制

使用前将PikoGreen dsDNA定量试剂回温至室温；PikoGreen以100 μL 200×的浓缩液形式保存于无水DMSO中的（共10管）。实验当天，根据实验需求用1×TE按1:200 的比例稀释适量定量试剂浓缩液。例如要准备足够的操作溶液以2 mL检测体系测定20个样品，可向19.9 mL 1×TE 中加入100 μL PikoGreen dsDNA 定量试剂。工作液见光易降解，尽量在配好后几小时内使用。

2. 配制标准品DNA溶液

（1）用1 X TE溶液溶解dsDNA制备1 μg/mL dsDNA 。根据在1 cm 光程长度的比色杯中A260 nm时的吸光度确定DNA 浓度；相应于1 μg/mLdsDNA 溶液A260=0.02。标准液常用小牛胸腺DNA制备，PikoGreen 试剂测定法在通常污染核酸制剂的几种复合物存在的条件下仍能保持线性良好，但是，为了得到有效的对照处理，被用来做标准曲线的dsDNA 溶液要用和实验样品相同的方式来处理，并且应该包含相同的可能存在的污染物。

（2）制备从0.5 ng/mL 到500ng/mL（见表1）单重复8 个点的标准曲线。配制一系列的标准DNA 溶液，然后与等体积的PikoGreen 工作液混和，放入1 x 1cm 比色杯中。混合相同体积的1 x TE 和PikoGreen 操作溶液作为空白对照,避光于室温下放置2~5 分钟。

表1: 用1 x 1cm 比色杯时DNA 标准浓度配制参考

（3） 当用微量检测皿适配器时，PikoGreen 测定也可在较低的测定体积（50 μL 到200 μL）内完成。产生从1 ng/mL 到100 ng/mL（见表2）的标准曲线，配制一系列的标准DNA 溶液，然后与等体积的PikoGreen 工作液混和，将至少50 μL 溶液转移到微量检测皿中。确信不要在样品中引入气泡，轻轻地弹微量检测皿的外部经常可以驱散气泡。避光于室温下放置2-5 分钟。

表2：用微量检测皿DNA 标准浓配制参考

（4） 孵育后用合适的荧光计测量样品荧光值。Ex/Em=480 nm/520 nm，为了减少光漂白，应保持所有样品的检测时间一致。用荧光值最大的样品校正仪器。

（5）用检测数据与DNA标准溶液浓度做回归分析，制作标准曲线。

3. 样品分析

（1）用1 x TE 稀释待测DNA 样品至需要的体积（1x1 cm 比色杯需1.0 mL，微量检测皿需25~100 μL）。对样品高度稀释可以确保任何污染物都被最大限度地冲淡。然而，也要避免取样体积太小而无法精确吸取的情况。

（2）在每个样品中加入等体积PikoGreen 工作液，混合好，将混合物移入合适的比色杯，避光于室温下放置2~5 min。

（3）检测、读取荧光值，换算样品中dsDNA浓度。可以对样品进行不同的稀释处理重复测定以确保结果的准确性。

注意事项

（1）PikoGreen定量试剂含有DMSO，PikoGreen 是结合dsDNA，操作时采取适当防护，戴手套小心操作；

（2）尽管常见污染物不会影响PikoGreen 检测dsDNA浓度（见表3），但是当样品中dsDNA浓度太低，RNA, ssDNA浓度超过dsDNA 10倍以上时，RNA, ssDNA等污染还是会对检测结果产生较大干扰，在此种情况下，RNA 酶可以消除RNA干扰, RNA 酶A、酶T1 、核酸酶S1 结合能除去ssDNA干扰，从而保证样品荧光值是由dsDNA 产生。

表3：Pikogreen定量耐受的污染物列表

特别提示：本公司的所有产品仅用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！