常用离心方法与离心机的应用

上海诺乔科学仪器有限公司

2024/05/27 09:19

根据离心原理，对不同样品的分离应选择不同的离心方法。一般低速离心时，若分离的样品颗粒的质量和密度与溶液相差较大，选择合适的离心转速和离心时间，就能达到较好的分离效果。

1.差速离心法

若样品中存在两种以上质量和密度不同的样品颗粒，可采用差速离心法。差速离心方法往往针对不同的离心速度和离心时间要求，使沉降速度不同的样品颗粒按批次分离。该方法主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒，实验室主要用于提取组织或细胞中的成分。

离心时需要把经破碎的组织或细胞加入离心管中，先低速离心取出上清液，弃去大的组织碎片及沉淀物，将上清液放入离心机高转速离心，将小的颗粒分离出来，直至达到所需要的分离纯度为止。

差速离心法的优点是：①操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀物分开，并可使用容量较大的角式转子；②分离时间短、重复性高；③样品处理量大。缺点是：分辨率有限，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，分离效果相对较差，不能一次得到纯颗粒。另外，差速离心法的壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀，此时颗粒被挤压，尤其是当离心力过大、离心时间过长时会使颗粒变形、聚集而失活。

1..密度梯度离心法

对于有密度梯度差异的样品介质，可采用密度梯度离心法，使沉降系数比较接近的物质得以分离。若不同样品颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内，离心时密度不同的物质颗粒因浮力差异或向下沉降，或向上漂浮，一直移到它们各自密度恰好对应的位置（等密度点），形成区带，可采用等密度梯度离心。

密度梯度离心法又称区带离心法，该法还分为速率区带离心法和等密度区带离心法。

密度梯度离心法主要用于沉降速度差别不大的微粒，将样品放在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度液中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。密度小的梯度液成分靠近旋转轴，密度大的梯度液成分远离旋转轴。在使用密度梯度离心之前，需要了解被分离颗粒之间的浮力密度和沉降速度，以便选择适合的密度梯度液、离心力、离心时间等参数。

速率区带离心法

是根据样品中不同组分粒子所具有的不同体积大小和不同的沉降系数将混合样品进行离心分离提纯的离心方法。离心结束后，混合样品中的不同组分将在梯度液柱的不同位置分别形成各自的区带，此时将区带取出，达到彼此分离的目的。这样只需通过一次离心就可以把混合样品中的各组分分离提纯，其纯度和回收率可达100%。速率区带离心的优点是分辨率高，组分的沉降系数相差20%以上的即可选用此法。缺点是由于梯度材料的限制，样品液浓度不能太高，否则操作条件很难控制。临床实验室常用 Percoll，Ficoll 及蔗糖分离液等对静脉血中的单个核细胞进行分离，用于淋巴细胞的免疫功能测定。

密度区带离心法

根据样品组分的密度不同而进行分离。在离心前需预先制备密度梯度液，包括被分离样品中所有粒子的密度。待分离的样品铺在梯度液表面或与梯度液先混合，离心开始后，梯度液由于离心力的作用逐渐形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度，与此同时，原来分布均匀的粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度时，粒子便上浮；在弯顶处粒子密度大于介质密度时，则粒子沉降，最后粒子进人到一个它本身的密度位置，即粒子密度等于介质密度。粒子形成纯组分区带与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关。因此，只要转速、温度不变，即使延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。

密度梯度离心法的优点是：①具有很好的分辨率，分离效果好，一次离心即可获得较纯的颗粒；②适用范围广，既能分离沉淀系数差的颗粒，也能分离有一定浮力密度的颗粒；③被分离颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，还能防止已形成的区带由于对流而引起不同区带的混合。密度梯度离心法的缺点是离心时间较长，需要制备梯度液，操作严格复杂等，因此在临床检验实验室用得较少。

2.分析型超速离心法

分析型超速离心机的最大转速为40 000 r/ min，随机可配备密度梯度收集仪，密度梯度泵，各种加样、取样器等附件。分析型超速离心机主要用于生物制药领域测定生物大分子的相对分子量。如生物大分子、DNA 制剂、病毒和蛋白质的纯度体计，生物大分手的构象变化等。制备型超速离心机的最大转速为100 000 r/min，最大离心力为802 400×g，主要用于生物学研究，是分离纯化细胞的主要工具，可用于细胞器、病毒的分离和浓缩。

离心机是生物学和医学实验室（包括临床检验实验室和研究性实验室）必备的工具，必须根据被沉淀、被分离、被纯化物质的特性和实验目的，正确地选择离心方法和离心机。

1.低速离心机的应用低速离心机是临床实验室常规使用的一类离心机，分离形式是固液沉降分离。临床实验室主要用于血浆、血清的分离，尿液、胸腹腔积液、脑脊液样本中有形成分的分离。

2.高速离心机的应用高速离心机的分离形式是固液沉降分离。临床实验室主要用于分子生物学检测，如乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒感染的患者血清标本中 DNA或 RNA的提取。基础研究实验室对各种生物细胞、无机物溶液、悬浮液及胶体溶液的分离、浓缩和提纯等也使用高速离心机。为了防止高速离心过程中温度升高而使酶类物质破坏以及生物分子变性失活，高速离心机大多设有制冷系统，此种离心机又称高速冷冻离心机。

3.超速离心机的应用超速离心机的分离形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离。主要在科研实验室应用，如对生物样本中亚细胞器的分离，病毒、核酸、蛋白质及多糖的分离等。

4. 专用离心机的应用离心机的发展趋势是逐渐向专业性专用离心机发展。目前在临床实验室使用的有输血用交叉配血离心机、微量毛细管离心机、尿液有形成分分离离心机、细胞涂片染色离心机等。

（1）输血专用离心机：临床输血实验室使用的一种带有标准化操作规程和限制性设定的专用离心机。最大转速为1500 r/min，最大相对离心力为182 ×g；工作转速设定为900 r/min，离心时间为2分钟。患者输血前血型（正、反定型）的鉴定、交叉配血试验，Coombs不完全抗体的检查，以及对输注血小板的患者进行血小板血型鉴定、血小板抗体的检查等实验中需要此种离心机。

（2）微量毛细管离心机：是临床实验室专用离心机，用于血细胞比容测定、微量血细胞比积值的测定、放射性核素微量标记物的测定等。离心操作程序自动化控制，最大容量一次可离心24根毛细管，最大转速为12 000 r/min，最大相对离心力为14 800 ×g。

（3）尿液有形成分分离离心机：专用于临床实验室尿液常规检查时有形成分的沉淀，通常与尿液工作站或尿沉渣流式细胞分析仪配套使用。此类离心机在低速离心机的基础上，设定了专用的水平转子。最大转速为4000 r/min，最大相对离心力为2810 ×g。

（4）细胞涂片染色离心机：临床实验室主要用于血液涂片、微生物涂片、脑脊液等涂片、染色。此种离心机的最大转速为2000 r/min，还设有专用水平杯式转子，操作程序为自动化控制。样品（如血液）经梯度离心分离出杂质，细胞从液体悬浮物中分离出来，被均匀地涂抹到载玻片上，白动干燥、固定后，染色液自动地喷射到转盘中的载玻片上，再经离心除去过剩的染液。用细胞涂片染色离心机进行自动化涂片，镜下可见细胞或细菌等分布均匀，其间无重叠，背景清晰，染色效果好。

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