支原体分型试验方法!百欧博伟生物
1、代谢抑制试验:根据特异性抗体能阻止支原体的生长及代谢这一特性,可采用已知高效价的免疫血清进行代谢抑制试验 以鉴别各种支原体。测定分解葡萄糖支原体时,可在含0.5——1.0%葡萄糖的支原体培养基中加入抗血清后再接种菌液,培养后未见发酵反应,培养基颜色不变;而未加抗血清的对照管呈发酵反应,培养基变成黄色。如加入的是抗肺炎支原体血清,即被检测的为肺炎支原体。代谢抑制试验还可用于感染支原体的患者血清抗体效价的检测。
2、反向血凝试验:取高效价的支原体抗血清先经50%硫酸铵沉淀初步提纯后,再经DEAE柱层析获得纯化IgG。先预试确定抗体致敏最适浓度,以鞣酸法将抗体包被于戊二醛化的绵羊红细胞上。抗体致敏的血细胞遇到相应抗原时,室温60min,则可出现特异的血细胞凝集反应。试验证明该法快速,1—2h即可获得结果,特异性和灵敏度高。
3、间接表面免疫荧光试验:此法的突出优点是能查出分离物中的混合感染株,而不需对分离物事先纯化。不需要制备各种支原体高免疫血清的荧光标记抗体,只要有一种羊抗兔荧光抗体即可。用特异性荧光抗体直接染色固体培养基上的支原体菌落,荧光显微镜检查被染菌落的荧光。当支原体菌落与同源兔抗支原体抗体结合后,再加羊抗兔荧光抗体,三位一体,在荧光显微镜下即可见典型的黄绿色荧光菌落。
先确定抗血清最适工作浓度,取支原体诊断血清用生理盐水制成不同稀释度(1:20—1:320),分别与已知相应的支原体菌落做间接表面免疫荧光试验,在荧光显微镜下以菌落着色荧光最强、背景最暗的抗血清z高稀释度作为最适工作浓度。
将待检菌株接种支原体固体培养基平板上,置二氧化碳条件下37℃培养5——7d,将带分散菌落的琼脂小心切下,菌面向下贴在洁净的载玻片上,每块玻片可放4—8个菌落。将玻片倾斜45°于80℃&蒸馏水容器中,约1min使琼脂块溶解滑下,立即用80℃蒸馏水清洗,并用pH7.2的PBS浸洗玻片3次;弃去洗液,室温干燥后,加入用pH7.2的PBS稀释至适宜浓度的抗血清;室温作用30min,用pH7.2PBS洗 3 次,每次30min,弃去洗液后加入适宜稀释的羊抗兔荧光抗体,作用30min后,用PBS洗 3 次,z后放4℃冰箱浸洗过夜;弃去洗液,待干后在荧光显微镜下观察菌落的荧光反应。菌落呈亮黄绿色特异性荧光,形态清晰者为阳性反应,属同源菌落;无荧光反应者为阴性。试验时应设阳性对照和加正常兔血清的阴性对照。间接表面免疫荧光试验具有较高的特异性和敏感性,缺点必须是活菌培养。
4、支原体菌数测定法:支原体的计数常采用以下两种方法。
①菌落形成单位(CFU)。将待检样品用支原体液体培养基以10倍递增稀释10(-1)——10(-12),取3个稀释度(10(-10)——10(-12))菌液0.1ml接种于直径5cm平板固体培养基上,每个稀释度接种平板 3 个,轻轻摇动平板,使菌液均匀铺平成圆形。置二氧化碳条件下37℃培育5—8天;在低倍或倒置显微镜下计数生长菌落,计算每毫升内生长的菌落数(CFU/ml)。
②颜色改变单位(CCU)。根据支原体生化反应的特性在培养其中添加葡萄糖(0.5%)、精氨酸(0.2%)或尿素(0.1%),同时加0.002%酚红指示剂;对分解葡萄糖支原体,培养基pH值调至7.8;分解精氨酸培养基pH值调至7.0;分解尿素的pH值调至6.0。试验方法是将培养基分装于无菌小试管中,每管1.8ml,第1管加入被检菌液0.2ml,混匀后吸取 0.2ml的至第2管,如此顺序进行10倍递增稀释10(-1)——10(-12),置37℃培育14d。以培养基颜色不继续发生改变为终点判定结果。以发生颜色变化的z高稀释度为颜色改变单位,如当10(-1)——10(-11)发生颜色改变,10(-12)无变化,即试验结果为CCU=10(-11),亦即被测菌液稀释至10(-11)仍有支原体生长。
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