原代细胞骨架的染色方法!
一、微丝的显示方法步骤:
1、用PBS液漂洗盖片培养的原代细胞3次,每次30s;
2、用2%的甲醛/PBS液固定原代细胞3min;
3、用0.5%的三硝基甲苯/PBS处理3次,每次10min;
4、PBS漂洗3次;
5、用罗丹明(rhodamine)标记的鬼笔环肽(phalloidin)(1:10)室温中反应15min;
6、PBS漂洗3次;
7、60%甘油+荧光防淬剂封片;
8、荧光显微镜观察;
二、微管的显示方法:
1、用PBS液漂洗盖玻片的原代细胞3次,每次30s;
2、在室温中用3%甲醛/PBS固定20min;
3、用PBS液再漂洗3次,每次1min,z后用滤纸吸干多余的PBS液;
4、投入冷丙酮中(-10—-20℃)7min;
5、用PBS漂洗3次,每次1min,z后用滤纸吸干多余的PBS液;
6、向直径6cm的干净碟皿中央滴一滴浓度为0.1—0.2mg/ml的一级抗微管蛋白抗体,令小盖片细胞面向下扣在抗体液上,覆以皿盖,于37℃温箱中放置45min—1h;
7、向碟皿内匀速缓慢滴加PBS,令盖片浮起在液面,用镊子夹出,按步骤3处理;
8、向干净碟皿中央滴一滴浓度为0.1—0.2mg/ml的荧光标记的二抗,其后操作按步骤6进行;
9、按步骤7和3操作;
10、滴pH8.5的90%的甘油/PBS少许于载玻片上,把小盖片的原代细胞面覆在大盖片上;
11、将盖片置于荧光显微镜下观察;
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